青蒿愈傷組織的誘導及化學成分變化規律研究*

郭新榮，李 晉，馬 琳，王振中，蕭 偉，常艷旭，

（1.天津市現代中藥重點實驗室，天津中醫藥大學，天津 300193；2.江蘇康緣藥業股份有限公司，連云港 222001）

·中藥研究·

青蒿愈傷組織的誘導及化學成分變化規律研究*

郭新榮1，李 晉1，馬 琳1，王振中2，蕭 偉2，常艷旭1，2

（1.天津市現代中藥重點實驗室，天津中醫藥大學，天津 300193；2.江蘇康緣藥業股份有限公司，連云港 222001）

[目的]建立青蒿愈傷組織快速繁殖的適宜培養基，測定其生長過程中次生代謝產物奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量變化。[方法]無菌條件下切取花序、葉和葉柄為外植體，接種于MS添加不同激素組合的培養基，進行誘導及繼代增殖培養，測定奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量。[結果]建立了青蒿花序、葉和葉柄愈傷組織快速繁殖的適宜培養基，繪制相對應的生長曲線，并確定了生長過程中次生代謝產物奎寧酸類化合物和香豆素類化合物的含量變化及最佳采收期。[結論]通過組織培養方式可以成功獲得青蒿愈傷組織生長曲線和生長過程中次生代謝產物的變化規律，對傳統中藥青蒿培養體系優化及工業化規模生產進行探索提供了一個新途徑。

青蒿；組織培養；奎寧酸；香豆素；次生代謝產物

青蒿載于西漢的《五十二病方》，為菊科黃花蒿(Artemisia annua L.)地上全草，廣泛分布于中國的重慶、廣西、四川、山東、江蘇等省份，具有抗虐、抗病毒、抗血吸蟲、抗菌，抗內毒素、活血殺菌和消炎鎮痛等作用。目前，青蒿的化學成分主要包括香豆素類、奎寧酸類、黃酮類、倍半萜內酯類化合物和揮發油等。香豆素類包括莨菪亭、東莨菪內酯、香豆素、7-甲氧基香豆素等[1-3]，具有解熱降溫等作用。奎寧酸類有綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B等[4-5]，具有抗氧化、抗菌等作用。揮發油具有清虛熱、涼血、除骨蒸、解暑等功效[6-7]。倍半萜內酯青蒿素以其高效、速效、低毒的優點被世界衛生組織稱為是世界上唯一有效的抗瘧藥物。黃酮類化合物具有抗氧化活性等[8-11]，可促進青蒿素與血晶素的反應，增強青蒿素的抗瘧性。上述研究表明，青蒿化學成分具有較大的開發利用價值。

目前青蒿化學成分主要從藥材全株中提取，產量受到地理環境和季節的限制，其需求量大，且有效成分含量低，不能滿足市場需求。為解決這一難題，國內外學者對青蒿的育種工作進行了大量探索。其中組織培養技術以其不受自然條件限制，能加速育種進程且不破壞自然資源等優點，對青蒿新品種的培育和推廣具有其他方法無法替代的優越性。焦小珂等[12]對青蒿同源四倍體的誘導及農藝性狀進行評價，表明應用多倍體育種技術，可以大幅度提高藥材產量，四倍體植株農藝性狀較二倍體有明顯的優越性。對青蒿花藥培養加以研究，結果發現青蒿花藥培養最適培養基是6-BA 1 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L或6-BA1mg/L+NAA0.3mg/L，無需低溫前處理和高溫后處理，即可通過青蒿花藥培養得到單倍體胚[13]。對青蒿叢生芽誘導影響因素加以研究，發現誘導叢生芽的激素組合是6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L，青蒿叢生芽的誘導及青蒿素的生物合成可以通過理化因子有效地進行調控[14]。這些對青蒿資源開發、保護和新品種的選育都有重要意義。

本研究擬通過組織培養方式，獲得青蒿愈傷組織生長曲線和生長過程中次生代謝產物的變化規律，結合超高效液相色譜（UPLC）方法，同時定量分析青蒿愈傷組織中奎寧酸類化合物和香豆素化合物類化合物，以期為青蒿愈傷組織培養的相關研究提供技術原理和工藝基礎，為大規模生產青蒿次生代謝產物創造技術基礎條件，同時為今后青蒿培養體系優化和綜合利用的產業發展提供借鑒。

1 試劑及方法

1.1實驗材料 青蒿種子取自江蘇省連云港市，于天津中醫藥大學室外栽培得到植株。

1.2儀器與試劑 SPX-300I-G型光照培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），LRH-250F生化培養箱（上海一恒科技有限公司），YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司），ZXC型紫外消毒車（江蘇巨光光電科技有限公司），SWCJ-2F型雙面凈化工作臺、Waters ACQUITYTMUltra Performance LC（美國Waters公司，包括二元梯度泵、柱溫箱、PDA檢測器、EMPOWER化學工作站），SB-1000 YDTD超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、水（超純水）、甲酸（色譜級）、6-芐氨基嘌呤（天津市光復精細化工研究所），2-4-二氯苯氧乙酸（上海藍季科技有限公司，SigmaD7299）。

1.3實驗方法

1.3.1愈傷組織消毒 參照文獻[15]對青蒿外植體的消毒條件，將田間栽培的青蒿，截取頂端約5～ 10 cm處生長能力較旺盛的帶葉莖段及未開放花序，先將其用洗衣粉水輕輕揉搓除去表面污垢，再將其用干凈的紗布包裹，置于流動自來水中沖洗2 h左右，紫外滅菌30 min，5%乙醇消毒30 s，帶葉莖段用0.1%升汞滅菌10 min，然后在滅菌過的培養皿上將其切成3～5 cm的小段。未開放花序用0.1%升汞滅菌改為5 min[16]。

1.3.2愈傷組織培養 1）愈傷組織的誘導：在無菌條件下將已消毒的青蒿花序、花枝及葉片剪碎，分別接種于含2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養基上[15-17]，在25℃條件下避光培養15 d，誘導愈傷組織。2）繼代培養：采用2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養基對花愈傷組織進行繼代培養，采用2，4-D0.5mg/L+6-BA 1 mg/L培基養對培養葉與葉柄愈傷組織進行繼代培養，獲得性狀穩定的愈傷組織。

1.3.3愈傷組織的鮮質量、干質量生長倍增曲線的繪制 按已確定的最優生長培養基配方配制固體培養基，滅菌分裝于培養皿中。將切好的脆散性愈傷組織稱質量后接種于編號的培養皿中，記錄m1。 25℃下暗培養，每3～4 d取樣1次，每次取樣3瓶，稱取愈傷組織鮮質量，記錄m2。將愈傷組織烘干至恒質量，稱質量記錄m3。每次取樣的愈傷組織鮮質量與干質量倍增值的計算方法：

愈傷組織鮮質量倍增值F=（m2-m1）/m1

愈傷組織干質量倍增值D=m3/m2

依據愈傷組織鮮質量與干質量倍增值的平均值繪制生長曲線。

1.4愈傷組織樣品處理方法 將樣品置于烘箱中，60℃烘至恒重，用瓷乳缽研磨至粉末狀。精密稱取0.1 g樣品，加10 mL 60%的甲醇，超聲提取50 min,靜置，以14 000 r/min，10 min離心2次，取上清液用UPLC分析方法進行化學成分測定。

1.5標準曲線的制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C標準品，甲醇溶解后，配制各濃度混標，分別取1 μL注入UPLC，記錄色譜圖。以進樣濃度（X）與峰面積（Y）作最小二乘法線性回歸，獲得回歸方程。

2 結果與討論

2.1誘導培養基的選擇 選擇以MS為基礎培養基[15-16，18]，通過對不同比例的2，4－D與6-BA組合優化，以誘導率為指標，考察了不同的培養基對外植體誘導的影響，發現MS+2，4-D0.1mg/L+6-BA0.5mg/L培養基，對青蒿葉片、葉柄和花序的誘導率為100%，見表1。因此選擇MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L作為青蒿不同外植體的誘導培養基。在4～5 d時，葉片在MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養基上開始卷曲，葉柄在接觸培養基部位出現膨大現象，花序在接觸培養基部出現膨大現象，部分出現淡白色愈傷組織，7～8 d時3種外植體出現淡綠色愈傷組織小團塊。

表1 不同培養基對青蒿外植體愈傷組織誘導的影響 %

2.2繼代培養基的選擇 以愈傷組織褐變率為指標，考察了不同培養基對不同外植體（葉、葉柄和花序）繼代培養的影響，結果發現應當采用2，4－D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L最為花序的愈傷組織繼代培養基時，幾乎無褐變現象，生長狀態良好，因此選擇2，4－D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L作為花序的愈傷組織繼代培養基。對于葉、葉柄在MS+2，4-D 0.5 mg/L +6-BA 1 mg/L培養基中生長相對較好，故選定其為葉和葉柄的繼代培養基。

圖1 不同培養時間對愈傷組織鮮質量和干質量的影響

2.3愈傷組織生物量變化規律研究 選擇長勢較好1.0 g淡黃色的愈傷組織，接種培養上，每3～4 d取樣1次，稱鮮質量和干質量。以愈傷組織鮮質量增殖系數、干質量生長倍增值的平均值為縱坐標，取樣時間為橫坐標，繪制不同外植體愈傷組織生長曲線，見圖1。從圖1中可知不同外植體愈傷組織干質量與鮮質量變化規律具有一致性。葉柄和葉基本符合“S”型曲線特征。在生長周期內，明顯分為4個時期：延遲期、指數期、穩定期和下降期。葉柄在0～ 12 d為生長滯后期，接著13～21 d為對數生長期，22～25 d則為穩定期，在23 d即達到其最大生長量。葉在前4 d鮮質量變化不明顯，接種后第10天細胞從延遲期進入對數生長期生長，第20天時達到1.98倍鮮質量生長量，以后細胞培養物鮮質量增長速度放緩，21～25 d為下降期，20天可達到最大生長量，如不及時更換新鮮培養基，細胞生長將停止。而花的愈傷組織延遲期較短，第3天開始即呈對數生長期，第13天即達到最大生長量，鮮質量增殖系數達到2.75，在21 d鮮質量有明顯增加，但此時愈傷組織褐變較多，含水量增大不宜再進行繼代培養，因此以生物量為指標，外植體葉柄和葉的愈傷組織的最大生物量在20 d左右，而花的的愈傷組織在13 d左右。

2.4愈傷組織中有效成分變化規律研究

2.4.1曲線標準的建立 本研究選擇了奎寧酸類化合物和香豆素化合物為指標，評價了不同外植體中化學成分的變化規律。利用UPLC的分析方法，對不同濃度標準品混合溶液進行測定，獲得各化學成分的峰面積，建立了各種化學成分的線性回歸方程，如表2所示，各化合物線性關系良好。

表2 7種化合物的線性范圍及回歸方程

2.4.2愈傷組織中化學成分含量測定 取不同培養天數的愈傷組織制備供試品溶液，注入UPLC，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算青蒿中各種化學成分的含量，見表3、表4、表5。從表3中可知，異綠原酸A為青蒿花序愈傷組織主要成分，綠原酸與異綠原酸A含量在第3天達到最高值，新綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸C在第13天達到最高值，而隱綠原酸和東莨菪內酯含量則在第17天達到峰值。

從表4可知，異綠原酸A為青蒿葉柄愈傷組織中的主要成分，與新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸C在第3天達到最高值，在23 d出現其次高峰，東莨菪內酯在第17天達到峰值，而異綠原酸B在第23天時含量最高。

從表5可知，異綠原酸A為青蒿葉愈傷組織中的主要成分，其含量最高，與新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C均在第17天時含量最高，隱綠原酸和東莨菪內酯則在第13天含量最高。

2.5不同愈傷組織中有效成分積累規律比較研究

次生代謝是植物為了適應特定的生活環境或受到病原微生物侵染后，產生并積累，用以增強自身的抵抗力，并不是細胞生命活動或植物生長發育所必需的。但與植物的抗病、抗逆有關，在提高植物的防御能力和處理生態環境關系上有著重要的角色。而中藥中的次生代謝產物則常常作為主要的藥效成分，并在中藥道地性的形成上有很重要的應用[18]。本實驗以青蒿愈傷組織中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和東莨菪內酯為主要的次生代謝產物進行定量研究。

表3 不同培養時間的花序愈傷組織中化學成分含量 %

表4 不同培養時間的葉柄愈傷組織中化學成分含量 %

表5 不同培養時間的葉愈傷組織中化學成分含量 %

累積含量（μg）=愈傷組織百分含量×愈傷組織干質量收獲量（g）

2.5.1花序愈傷組織有效成分變化規律

對于花的愈傷組織而言，新綠原酸和綠原酸在第21天達到最高值，而異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C在第10天達到最高值，隱綠原酸和東莨菪內酯在第17天達到最高值，其中異綠原酸B和異綠原酸A在21 d時又有回升趨勢，但此時愈傷組織開始褐變，含水量增大，生長狀態不好，不宜再做繼代培養，見表6。

2.5.2葉柄愈傷組織有效成分變化規律 對于葉柄的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸A在第23天達到最高值，隱綠原酸和東莨菪內酯在第17天達到最高值，異綠原酸C在21 d達到最高峰。見表7。

表6 花序愈傷組織中化學成分的累積變化 μg/g

對于葉的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B在第17天達到最高值，異綠原酸A和異綠原酸C在第13天達到最高值，東莨菪內酯在第10天達到最高值，見表8。

結合愈傷組織生長曲線變化規律與有效成分變化，發現花序愈傷組織次生代謝產物新綠原酸與綠原酸生長曲線變化一致，而異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C則提前到達最大收獲量，隱綠原酸和東莨菪內酯則向后推遲，其中異綠原酸B、異綠原酸A在21 d時又有回升，其主要原因可能是細胞開始向褐變發展，從而促進了奎寧酸類次生代謝產物的積累。對于葉柄的愈傷組織而言，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C與生長曲線變化一致，隱綠原酸和東莨菪內酯在第17 d達到最值，在21 d后各個化合物均達到穩態，可作為最佳的繼代培養愈傷組織。對于葉的愈傷組織而言，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、在第17天達到最高值，而異綠原酸A和異綠原酸C則在第13天即達到最佳收獲期，可能是細胞高度脫分化抑制了次生代謝產物積累的原因造成的。

3 結論

本研究通過添加外源性激素2，4-D和6-BA成功的誘導出了青蒿花序、葉和葉柄的愈傷組織，呈現出淡黃色，結構疏松且生長迅速，易于分離的特點，將此愈傷組織進行數次繼代，得到遺傳性狀穩定的愈傷組織。其中花序、葉和葉柄愈傷組織誘導培養基均為2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，而繼代培養基略有變化，葉和葉柄的繼代培養基更改為2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1 mg/L。花序愈傷組織生長周期最短，奎寧酸類化合物在13 d左右即可得到較高的累積量，而東莨菪內酯則在17 d為最高的收獲量。葉柄的愈傷組織的各化合物含量及累積量均最高，奎寧酸類化合物在21 d左右為最佳收獲期，而東莨菪內酯則在17 d達到最高量。結合細胞次生代謝產物的積累和細胞生長周期，建議以葉柄為外植體，以MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為誘導培養基，以MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1 mg/L為繼代培養基，生長周期為21 d可獲得青蒿次生代謝產物含量最高，細胞生長狀態最好的愈傷組織，為傳統中藥青蒿培養體系優化及工業化規模生產進行探索提供了一個新途徑。

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表7 葉柄愈傷組織中化學成分的累積變化 μg/g

表8 葉愈傷組織中化學成分累積變化 μg/g

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Establishment of rapid callus proliferation culture system and evaluating content of secondary metabolite in Herba Artemisiae Annuae

GUO Xin-rong1,LI Jin1,MA Lin1,WANG Zhen-zhong2,XIAO Wei2,CHANG Yan-xu1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2 Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222001,China）

[Objective]To establish the rapid callus proliferation culture system of Herba Artemisiae Annuae and determine the content of phenylpropionic acids and coumarins.[Methods]The inflorescence,leaf and petiole were cut down and selected as explant and induced into callus under sterile conditions.Then,the callus was planted in MS with different combinations of different hormones.Finally,the content of phenylpropionic acid and coumarins was determined.[Results]The rapid callus proliferation culture system of Herba Artemisiae Annuae was established successfully by tissue culture.Kinetics of growth accumulation and the best harvest of phenylpropionic acid and coumarins biosynthesis were evaluated.[Conclusion]Kinetics of growth accumulation of secondary metabolites of Artemisia Annue can be successfully established by tissue culture.These methods provide a new way to explore the variation of the secondary metabolites in culture system optimization and industrial scale production of Artemisia Annua.

Artemisia annua;tissue culture;quininic acid;coumarin compounds;secondary metabolites

R285.5

：A

：1673－9043（2014）04－0219-06

2014-02-15）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.09

“重大新藥創制”科技重大專項資助項目（2010 ZX09502-005）；中國博士后特別基金資助項目（2012 T50239）；江蘇省博士聚集計劃；天津市科技支撐計劃重大項目（10ZCZDSY12400）。

郭新榮（1986－），女，碩士研究生，從事中藥藥效物質基礎研究工作。

常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com；蕭 偉，E-mail: xiaowei@163.com。