肺炎克雷伯菌突變株的分離和全轉(zhuǎn)錄組分析

劉 巖，常 德，黃佩佳，姜學(xué)革，蘇龍翔，岑 忠，劉長庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2武警總醫(yī)院 呼吸科，北京 100039；3深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

基礎(chǔ)研究

肺炎克雷伯菌突變株的分離和全轉(zhuǎn)錄組分析

劉 巖1，常 德2，黃佩佳1，姜學(xué)革1，蘇龍翔1，岑 忠3，劉長庭1

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2武警總醫(yī)院 呼吸科，北京 100039；3深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

目的篩選空間環(huán)境誘變的肺炎克雷伯菌突變株及并進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。方法利用Biolog生化反應(yīng)板從搭載于神舟八號飛船的肺炎克雷伯菌中篩選突變株，然后采用高通量測序技術(shù)對突變株全轉(zhuǎn)錄組測序，原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)處理后進(jìn)行基因表達(dá)注釋和差異表達(dá)基因的基因本體功能及京都基因與基因組信號通路注釋分析。結(jié)果空間搭載的肺炎克雷伯菌突變株在糖類代謝上出現(xiàn)差異，且該菌株有232個基因表達(dá)上調(diào)，1 879個基因下調(diào)，其主要同細(xì)菌的膜蛋白、轉(zhuǎn)運相關(guān)功能、糖類的運輸相關(guān)。結(jié)論獲得一株空間環(huán)境誘導(dǎo)的肺炎克雷伯菌突變株且該菌株全轉(zhuǎn)錄組測序和注釋清晰，為后續(xù)的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

克雷伯菌，肺炎；轉(zhuǎn)錄組；測序；空間環(huán)境

克雷伯菌是革蘭陰性桿菌，屬于腸桿菌，屬兼性厭氧菌，常存在于人體上呼吸道和腸道中[1]。肺炎克雷伯菌是一種無處不在的條件致病菌，寄生在人類的呼吸道，對人致病性較強(qiáng)，并導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如敗血癥、肺炎、尿路感染、軟組織感染[2-3]。隨著航天技術(shù)的發(fā)展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。在載人航天活動中，肺炎克雷伯菌可隨航天員進(jìn)入太空，暴露于空間環(huán)境下的該菌株是宇航員健康的潛在威脅。因此，研究空間環(huán)境下肺炎克雷伯菌的變異及其規(guī)律對載人航天具有重要的意義。

材料和方法

1 材料 肺炎克雷伯菌(LCT-KPD)為地面對照組，來自中國菌種保藏中心。肺炎克雷伯菌(LCTKPT)為空間搭載組，從搭載于中國神舟八號飛船的肺炎克雷伯菌中分離獲得。高通量測序儀HiSeq 2000為Illumina公司生產(chǎn)，Biolog生化反應(yīng)板GENⅢMicroPlateTM來自美國Biolog公司，總RNA提取試劑盒購自天根公司。

2 突變株的分離 將返回地面的搭載神舟八號飛船肺炎克雷伯菌接種于MH平板中，挑選100株單克隆子代菌株并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取2 ml菌液6 000 r/s離心5 min，棄上清，用0.9%氯化鈉注射液洗滌菌體，用Biolog接種液懸浮菌體后，調(diào)整濃度為107～ 108/ml；菌懸液加入Biolog板孔中，放置在37℃下培養(yǎng)，24 h和48 h進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。

3 RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測序 利用天根細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取肺炎克雷伯菌對照組和實驗組總RNA，利用Agilent 2100、Qubit Fluorometer、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度、片度大小、RIN、沉降系數(shù)(S)28和18。去除rDNA后，將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加PolyA并連接測序接頭，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。

4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的過濾和評估 經(jīng)測序獲得的原始序列帶有Adaptor序列或低質(zhì)量序列，通過軟件去除含Adaptor序列的最小誤取單位，實際未測出堿基(N)比例＞5%的Reads、低質(zhì)量Reads，得到純凈(clean)Reads。利用SOAPaligner/soap2軟件將Clean reads比對到參考基因組和參考基因序列，統(tǒng)計Clean reads比對到參考基因組、參考基因上的比例，獲得對數(shù)據(jù)的總體評估。用Clean reads比對參考rRNA序列，評估rRNA序列以利于后續(xù)分析中去除這些數(shù)據(jù)；為進(jìn)一步分析測序的可靠性，通過把Reads在基因上的位置標(biāo)準(zhǔn)化到相對位置，統(tǒng)計基因的不同位置比對上的Reads數(shù)，以評估測序過程中的打斷隨機(jī)性。

5 基因表達(dá) 注釋每個基因被Reads覆蓋的百分比，通過分析基因的覆蓋度進(jìn)一步評估測序數(shù)據(jù)；利用每個堿基長度Reads數(shù)(reads per kilobase of exon model per million mapped reads，RPKM)法計算基因表達(dá)量以進(jìn)行差異基因的表達(dá)分析。獲得差異表達(dá)基因后，對其進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組(Kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG)信號通路的注釋分析，從而明確空間環(huán)境誘導(dǎo)的突變株表達(dá)改變基因的分類，為研究空間環(huán)境對肺炎克雷伯菌的作用提供線索。

結(jié)果

1 突變菌株的篩選和分離 對隨機(jī)挑選的100株子代細(xì)菌進(jìn)行Biolog表型譜研究后，發(fā)現(xiàn)其中一株菌株在利用D-海藻糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸、D-甘露醇、肌醇、黏液酸、D型砂糖酸和α-酮戊二酸等底物方面存在差異(表1)，因此將該株肺炎克雷伯菌作為研究對象進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)錄組序列測定和分析。

圖 1 LCT-KPT及LCT-KPD的基因覆蓋度Fig.1 Distribution of genes' coverage of LCT-KPT and LCT-KPD

表1 地面對照和空間搭載組間Biolog代謝譜差異Tab. 1 Phenotypic characteristics of LCT-KPTand LCT-KPD

表2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果同參考基因組比對的統(tǒng)計結(jié)果Tab. 2 Alignment statistics of sequencing results mapped to Genome (n, %)

2 轉(zhuǎn)錄組基因覆蓋度分析 將轉(zhuǎn)錄組測序Reads對比至原始菌株基因組和基因上，95%以上Reads都能比對至參基因組上(表2)，比對至參考基因上的Reads比例也達(dá)到36.03%，表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果基本能反映研究菌株的整個轉(zhuǎn)錄組。從基因覆蓋度的角度也證實基因組上大部分基因已覆蓋(圖1)。這些測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量、數(shù)量分析和評估為后續(xù)的基因表達(dá)差異分析奠定了基礎(chǔ)。

3 基因差異表達(dá)分析和注釋 通過測序獲得兩組樣本基因的表達(dá)量，按FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計，同地面對照相比，太空搭載組有232個基因表達(dá)上調(diào)，1 879個基因下調(diào)。GO功能注釋分析集中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白；KEGG信號通路注釋改變磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)、ABC轉(zhuǎn)運器、果糖和甘露糖代謝、丁酸代謝、磷酸肌醇代謝、半乳糖代謝、二甲苯降解、丙酸代謝、苯丙氨酸代謝、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、苯甲酸降解和維生素C代謝(P＜0.01)(表3)。由此可見，空間環(huán)境突變株在細(xì)菌的膜蛋白、轉(zhuǎn)運相關(guān)功能、糖類的運輸、磷酸化等方面變化明顯，表明糖類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對于細(xì)菌的生存十分重要，同時細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性變化受糖類運輸系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

討論

隨著我國“神舟”系列飛船、“天宮一號”、空間站等龐大航天計劃的實施，為空間生物醫(yī)學(xué)研究提供了難得的實驗平臺。借助太空失重、高真空、微磁場和粒子輻射等特殊的環(huán)境，利用空間飛行器的特殊實驗條件，科學(xué)家們可以開展許多地面上無法實現(xiàn)的科學(xué)實踐和研究活動，最終再惠及地面[4]。美國航空航天局2008年開展的肺炎鏈球菌空間研究項目發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在太空空間環(huán)境中的毒力和致病性會發(fā)生改變，對外界環(huán)境抵抗力增強(qiáng)以及對抗生素的敏感性下降[5-6]。因此，通過空間搭載研究空間環(huán)境對細(xì)菌的作用和影響機(jī)制有利于評估空間生物安全，另一方面，為地面研究細(xì)菌變異提供新手段。

肺炎克雷伯菌又稱肺炎桿菌，是一種廣泛分布于自然界的最常見革蘭陰性菌，為人體的正常菌群。在接受侵入性診療或者免疫功能低下的患者中常可導(dǎo)致呼吸道感染、尿路感染、腹腔感染、敗血癥、化膿性腦膜炎、皮膚軟組織感染和傷口感染等，是腸桿菌科克雷伯菌屬中對人致病性較強(qiáng)的重要機(jī)會性致病菌和醫(yī)源性感染菌[3]。近年來隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用，其檢出率和耐藥率呈上升趨勢[7]。地面的研究手段非常有限；另一方面，該種機(jī)會性致病菌可隨航天員進(jìn)入太空，嚴(yán)重威脅載人航天的安全[8]。因此，為更好了解肺炎克雷伯菌株的各項生物學(xué)特性和空間變異規(guī)律，為保障航天員健康和臨床診治提供基礎(chǔ)，我們利用全新的測序技術(shù)對該菌株進(jìn)行基因組測序。

本研究借助神舟飛船搭載平臺，將肺炎克雷伯菌搭載于神舟八號飛船，返回地面后通過表型篩選獲得突變株[7,9-10]。進(jìn)而對突變株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到一批表達(dá)差異的基因，這些基因主要分布于膜蛋白，參與糖類代謝、磷酸化和轉(zhuǎn)運等相關(guān)功能，為研究肺炎克雷伯菌的地面和空間變異提供了大量的候選分子。然而，本研究中搭載的肺炎克雷伯菌主要受失重的影響，后續(xù)的搭載研究可考慮讓其暴露于更加真實的空間環(huán)境。

表3 差異表達(dá)基因的KEGG信號通路注釋分析Tab. 3 KEGG pathway annotation of DEGs (n, %)

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Isolation and transcriptome sequencing of Klebsiella pneumonia mutant strain

LIU Yan1, CHANG De2, HUANG Pei-jia1, JIANG Xue-ge1, SU Long-xiang1, CEN Zhong3, LIU Chang-ting1
1Department of Respiratory Diseases in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Respiratory Medicine, General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces, Beijing 100039, China;3BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, Guangdong Province, China

LIU Chang-ting. Email: liuchangt@gmail.com

ObjectiveTo screen the space environment induced Klebsiella pneumonia mutant strain and study its transcriptome.MethodsThe Klebsiella pneumonia mutant strain was screened from which loaded on Shenzhou-Ⅷ space craft using Biolog GEN Ⅲ Micro Plate TM. Then whole transcriptome was sequenced with high-throughput sequencing technology, and gene expression annotation, GO annotation and KEGG signaling pathway annotation were analyzed for differentially expressed genes with processed raw sequencing data.ResultsKlebsiella pneumoniae mutant showed differences with controls in carbohydrate metabolism. This mutant strain had 232 genes up regulated and 1879 genes down regulated, which were mainly associated with bacterial membrane proteins, transportrelated functions and carbohydrate transport.ConclusionOne space environment-induced Klebsiella pneumoniae mutan strain is obtained, and the whole transcriptome sequencing and annotation are clear, which lays foundation for subsequent functional studies.

Klebsiella pneumonia; transcriptome; sequencing; space environment

R 85

A

2095-5227(2014)12-1234-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.12.016

時間：2014-08-29 09:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140829.0957.001.html

2014-06-16

國家“973”重點基礎(chǔ)研究計劃(2014CB744400)；武器預(yù)研重點基金(9140A26040312JB10078)；載人航天領(lǐng)域項目(040203)；國家自然科學(xué)基金(81350020)

Supported by National “973” Program for Basic Research of China(2014 CB744400); the National Natural Science Foundation of China(81350020)

劉巖，女，主管技師。Email: lymtk@126.com

劉長庭，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。Email: liuchangt@gmail.com