冬凌草甲素和survivin反義核苷酸對前列腺癌細胞作用的研究

李 進楊羅艷吳洪濤

1. 湘潭市中心醫院泌尿外科（湖南湘潭 411100）; 2. 中南大學湘雅二醫院泌尿外科

冬凌草甲素和survivin反義核苷酸對前列腺癌細胞作用的研究

李 進1楊羅艷2吳洪濤2

1. 湘潭市中心醫院泌尿外科（湖南湘潭 411100）; 2. 中南大學湘雅二醫院泌尿外科

目的探討冬凌草甲素聯合survivin反義核苷酸（反義鏈）對前列腺癌PC-3細胞株增殖和凋亡以及survivin mRNA和蛋白的影響。方法常規培養PC-3細胞，用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）檢測survivin反義鏈聯合冬凌草甲素對PC-3細胞增殖的影響；流式細胞儀（FCM）檢測PC-3細胞凋亡率；以CalcuSyn藥效學軟件計算聯合指數（CI）評價survivin反義鏈聯合凌草甲素對PC-3細胞的聯合效應，并通過熒光定量PCR和Western blot方法檢測PC-3細胞survivin基因和蛋白表達變化。結果survivin反義鏈轉染PC-3細胞后，可以顯著抑制PC-3細胞增殖，且能誘導PC-3細胞凋亡；冬凌草甲素聯合survivin反義鏈對PC-3細胞增殖抑制率較兩者單用組明顯增強，顯示出協同效應（Fa＜0.8）；冬凌草甲素和survivin反義鏈聯用對PC-3細胞凋亡誘導作用更為顯著（P＜0.01）；熒光定量PCR及Western blot顯示反義鏈和冬凌草甲素均使survivin mRNA和蛋白表達下降，兩者聯合使survivin mRNA和蛋白表達下降更明顯（P＜0.01）。結論 survivin基因反義鏈和冬凌草甲素均能明顯抑制PC-3增殖、誘導細胞凋亡和下調survivin基因和蛋白表達；兩者聯合作用有協同效應。

冬凌草素; 前列腺腫瘤; 細胞系, 腫瘤; 細胞增殖; 細胞凋亡

前列腺癌是一種嚴重影響老年人生活質量的惡性腫瘤，在西方發達國家其發病率及病死率分別位居男性惡性腫瘤的第2位及第6位[1]。隨著我國人口老齡化、生活方式改變等因素，我國前列腺癌患病率呈逐年升高趨勢。對激素、化療和放療不敏感是激素非依賴性前列腺癌治療過程中面臨的難題，因此，尋找新的治療方法仍是當前研究的熱點。冬凌草甲素（Oridonin）是從冬凌草等植物中提取出來的一種天然活性物質。近年來，冬凌草甲素在前列腺癌等多種腫瘤中顯示出抗癌作用[2]，我們先前的研究表明冬凌草甲素可誘導雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞凋亡[3]。survivin（生存素）屬于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的新成員，在多種腫瘤組織中高表達，具有抗細胞凋亡的作用[4,5]。采用siRNA抑制survivin表達可減弱前列腺癌細胞惡性表型，可能為雄激素非依賴性前列腺癌的基因治療提供了一種新方法[6]。我們研究脂質體LipofectamineTM Reagent介導survivin 反義鏈聯合冬凌草甲素對PC-3細胞增殖、凋亡及survivin基因和蛋白表達的影響，為survivin 反義鏈聯合冬凌草甲素治療雄激素非依賴性前列腺癌提供一定的實驗依據。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

冬凌草甲素購自中國科學院昆明植物研究所，用二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）配制成50mmol/L母液置-20℃，備用；MTT購自Sigma公司；survivin反義鏈、錯配鏈（與反義寡核苷酸相同堿基組成、不同排列順序）由上海生工生物工程公司合成，兩端3個堿基經硫代修飾以對抗核酸酶的降解。反義鏈：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’；錯配鏈：5’-GCCACTCCTCGA CTC TCG TC-3’。陽離子脂質體Lipofeetin購于Invitrogen公司。survivin上游引物5’-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3’和下游引物5’-CTTTCTTCGCAGTTTCCTC-3’，β-actin上游引物5’- CTCCATCCTGGCCTCGCTGT -3’和下游引物5’- GCTGTCACCTTCACCGTTCC -3’由上海生工生物工程公司合成。兔抗人survivin抗體及HRP標記的二抗購于Santa Cruz公司，鼠抗人β-actin抗體購自Jackson-Immuno research公司。ECL試劑盒購自Amersham公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自BECTON DICKINSON公司；MultiSkan Ascent酶標儀為芬蘭Thermo公司產品；BD FACSCalibur型流式細胞儀為BECTON DICKINSON公司產品。Lamda Bio10型紫外分光光度計為美國Perkin Elmer公司產品；PAC200型電泳轉膜系統及Mini-PROTEAN II 電泳槽為美國Bio-Rad公司產品。

二、細胞培養

PC-3細胞（南京凱基生物有限公司）養于含10%滅活新生牛血清的F12培養基（Gibco公司產品，加入L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素）中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中常規培養。

三、分組和轉染

取對數生長期的PC-3細胞，接種于25mL培養瓶，調整細胞濃度，使每瓶的細胞數為3×106，常規條件下培養24 h，顯微鏡下觀察，約80 %融合時開始實驗。設置空白對照組、脂質體轉染對照組、錯配鏈轉染對照組和反義鏈轉染組，每組設3 個復瓶。按Lipofectin 2000 轉染試劑盒說明進行細胞轉染，24后收集各組細胞并用于試驗。

四、MTT法檢測survivin反義鏈單獨或聯合冬凌草甲素對PC-3細胞增殖抑制率

取對數生長期的PC-3，加入96孔培養板中，分5組，每組6個平行孔。（1）空白對照組：只加PC-細胞作為對照；（2）錯配鏈組：調整錯配鏈的終濃度為0.4 pmol/L轉染細胞；（3）反義鏈組：以相同濃度反義鏈轉染細胞；（4）聯合組（反義鏈+冬凌草甲素）：反義鏈轉染24h后的PC-3細胞中加入終濃度為10μmol/L冬凌草甲素；（5）冬凌草甲素組：終濃度為10μmol/L的冬凌草甲素。所有 PC-3細胞繼續于37℃、5%CO2的培養箱中培養48h后，終止反應時加入10μL 5g/L MTT，37℃培養4 h中止，0.25%的胰酶消化收集細胞，每孔再加入200μL DMSO，震蕩1 min。選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光值(A)。按公式：抑制率（%）=（1-A實驗／對照）×100%計算細胞生長抑制率

五、survivin反義核酸單獨或聯合冬凌草甲素對PC-3細胞株凋亡的影響

取對數生長期的PC-3，取2mL接種于6孔板，調整細胞濃度，使每孔的細胞數為3×105，分組同前，每組6個平行孔， 48h后用0.25%的胰酶消化收集細胞，加入Annexin V-FITC/PI，流式細胞儀上進行細胞凋亡檢測（按試劑盒說明書進行操作）。

六、熒光定量PCR檢測轉染后PC-3細胞survivi的mRNA表達

取對數生長期的PC-3，接種于25mL培養瓶，調整細胞濃度，使每瓶的細胞數為3×106，分組同前，培養48h后收集細胞。取部分細胞用Trizol法提取總RNA，測RNA含量及純度，采用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，合成的cDNA模板-20℃保存備用。使用SYBRGreen I熒光染料進行定量PCR反應。模板2μL，Survivin和β-actin上下游引物各1μL，與10μL混合染料混合，超純水補足體積至20μL，混勻后放入PCR熱循環儀中進行反應。軟件自動進行數據分析，調整基線。計算出的Thresholdcycle（Ct值）以及各組survivin和β-actin Ct值的比值。

七、Western blot檢測轉染后PC-3細胞survivin蛋白表達

同時收集上述處理細胞，按蛋白質抽提、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、抗體孵育和顯色步驟進行Western印跡分析survivin蛋白表達。圖像半定量灰度掃描儀計算出的survivin和β-actin的灰度值以及各組survivin和β-actin 灰度值的比值。

八、統計學方法

不同處理組Survivin的mRNA和蛋白、細胞生長抑制率、細胞凋亡率比較采用t檢驗統計法分析；各種統計圖采用SPSS11.5 for windows及Microsoft Excel統計軟件獲得。以MTT法檢測細胞抑制率并依據C1ou-Talalay中效原理以CalcuSyn藥效學分析軟件計算協同作用指數CI 值，評價聯合作用效應，CI＜l 時兩藥為協同作用，CI=1時為相加作用，CI＞l 時為拮抗作用[7]。

結 果

一、MTT法檢測PC-3細胞增殖

反義鏈組及冬凌草甲素組均可抑制PC-3細胞的增殖（P＜0.05），而錯配鏈組對PC-3細胞的增殖無抑制作用；反義鏈聯合冬凌草甲素時對PC-3細胞的增殖抑制作用高于單用反義鏈組和冬凌草甲素組（P＜0.01）（表1）。軟件分析結果顯示反義鏈聯合冬凌草甲素的協同作用指數CI值＜0.8，顯示兩者為協同效應。

二、流式細胞儀檢測PC-3細胞凋亡

與對照組相比，反義鏈組、冬凌草甲素組和聯合組均能誘導細胞凋亡（P＜0.01），聯合組較反義鏈組和冬凌草甲素組誘導細胞凋亡率增高，差異有統計學意義（P＜0.01），（表1，圖1）。

表1 各組細胞生長抑制率和凋亡率（±s）

表1 各組細胞生長抑制率和凋亡率（±s）

注：與對照組比較，*為P＜0.05；與反義鏈組比較，**為P＜0.01；與冬凌草甲素組比較，▲為P＜0.01

組別 次數 抑制率 凋亡率對照組 5 0 4.5±1.5錯配鏈組 5 2.8±0.08**5.8±1.8**反義鏈組 5 22.5±2.1*14.5±3.1*冬凌草甲素組 5 38.5±5.8*16.5±4.8*聯合組 5 65.2±8.4**▲32.2±5.4**▲

圖1 Annexin V-FITC/PI 標記的PC-3細胞凋亡率檢測（流式細胞儀）

三、熒光定量PCR檢測survivin mRNA表達的影響

反義鏈組和冬凌草甲素組survivin mRNA水平較對照組及錯配鏈組水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），聯合組較反義鏈組和冬凌草甲素組水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

四、Survivin蛋白表達的影響

從Western blot印跡結果可以看出（圖2、3），反義鏈組、冬凌草甲素組和聯合組較對照組survivin蛋白水平明顯下降，圖像半定量掃描分析比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。聯合組較反義鏈組和冬凌草甲素組水平也明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組PC-3細胞survivin mRNA和蛋白與β-actin比值結果

圖3 各組PC-3細胞Survivin蛋白表達的Western blot印跡結果

討 論

survivin是至今發現的作用最強的凋亡抑制因子，具有抑制凋亡和調節細胞分裂的雙重功能，參與細胞增生、分裂、細胞周期及細胞凋亡的調控，與腫瘤的發生密切相關。survivin的高表達可以使腫瘤細胞免受各種凋亡信號的刺激而幫助細胞存活[8]。survivin表達水平下調可以直接調節腫瘤細胞自身凋亡，增加腫瘤細胞對化療或放療敏感性。研究發現p53蛋白和survivin形成一個復雜的信號網絡，控制野生型p53-survivin的下游的途徑，有助于控制腫瘤細胞增殖、存活和凋亡[9]。研究表明國人前列腺癌中均檢測到survivin表達，且survivin高表達患者的生存率相對低表達患者明顯降低，而復發率則升高，與前列腺癌患者預后密切相關[10]。Koike等[11]研究表明抑制survivin是治療激素難治性前列腺癌的一種潛在治療選擇。臨床試驗表明冬凌草甲素對多種腫瘤細胞有明顯的抑制或殺傷作用，有較強的抗菌消炎作用，毒副作用較小[12]，Zhang等的研究顯示冬凌草甲素納米混懸劑在雄激素非依賴性前列腺癌的治療中顯示了巨大的潛力[13]。我們早期的研究也表明冬凌草甲素可誘導PC-3細胞凋亡[3]。

我們應用脂質體轉染survivin反義核酸，作用于前列腺癌細胞系PC-3細胞，可誘導PC-3細胞凋亡、抑制細胞增殖，并使得survivin 的mRNA及蛋白表達明顯下降，表明survivin 反義鏈能在轉錄和翻譯水平上有效抑制survivin的表達。反義鏈組和冬凌草甲素聯合組survivin蛋白和mRNA表達較反義鏈組和冬凌草甲素組水平明顯下降，MTT法檢測示反義鏈組、冬凌草甲素組PC-3細胞生長抑制率升高，反義鏈聯合冬凌草甲素時表現出協同抑制PC-3細胞增殖作用。流式細胞儀檢測示反義鏈組、冬凌草甲素組PC-3細胞凋亡率升高，反義鏈聯合冬凌草甲素凋亡誘導作用增加，說明survivin反義鏈增加冬凌草甲素的誘導PC-細胞凋亡、抑制細胞增殖作用。

本實驗survivin反義鏈聯合冬凌草甲素作用PC-細胞對PC-3細胞誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖具有協同作用，說明有效抑制PC-3細胞survivin基因的表達能增強冬凌草甲素對該細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用。Pennati等[14]構建了表達靶向Survivin的核酶載體，轉染前列腺癌細胞DU145、PC-3，穩定表達核酶的細胞較對照組survivin的表達量明顯下降，并出現Caspase-9依賴的凋亡，survivin表達的下調還導致前列腺癌細胞對順鉑的增敏，抑制接種于裸鼠的前列腺癌細胞形成腫瘤。我們之前的研究顯示冬凌草甲素可通過線粒體途徑誘導PC-3細胞凋亡，因此，推測Survivin反義鏈和冬凌草甲素對前列腺癌細胞的協同作用可能是通過兩個凋亡途徑的共同通路實現。由于survivin在前列腺癌組織中表達，而在正常前列腺中未見表達，使得針對survivin的治療具有良好的靶向性、特異性和安全性。反義技術治療腫瘤從基因翻譯和轉錄環節特異地阻斷靶基因的表達。采用基因技術抑制survivin蛋白表達，可解除survivin對凋亡的抑制作用，誘導腫瘤細胞凋亡，達到治療目的，而且由于其表達的特異性，survivin反義寡核苷酸不會誘導正常細胞凋亡。因此，以survivin為靶基因的前列腺癌治療研究，為前列腺癌的基因治療聯合藥物治療開辟了新的途徑。

1 Jemal A, Bray F, Center MM,et al. Global cancer statistics.CA Cancer J Clin2011; 61(2): 69-90

2 Chen JH, Wang SB, Chen DY,et al. The Inhibitory Effect of Oridoninon the Growth of Fifteen Human Cancer Cell Lines.Chin J Clin Oncol2007; 4(1): 16-20

3 李進, 楊羅艷, 吳洪濤. 冬凌草甲素誘導人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞凋亡及其機制. 中南大學學報·醫學版 2011; 36 (8): 754-759

4 Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expression in cancer and lymphoma.Nat Med1997; 3(8): 917-921

5 Mesri M, Wall NR, Li J,et al. Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirus.J Clin Invest2001; 108(7): 981-990

6 Shen J, Liu J, Long Y,et al. Knockdown of survivin expression by siRNAs enhances chemosensitivity of prostate cancer cells and attenuates its tumorigenicity.Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)2009; 41(3): 223-230

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12 劉淑云, 譚英姿, 范明松, 等. 冬凌草甲素研究進展. 中國當代醫藥 2012; 19(13): 17-18, 20

13 Zhang Z, Zhang X, Xue W,et al. Effects of oridonin nanosuspension on cell proliferation and apoptosis of human prostatic carcinoma PC-3 cell line.Int J Nanomedicine2010; 5: 735-742

14 Pennati M, Binda M, Colella G,et al. Ribozyme-mediated inhibition of survivin expression increases spontaneous and drug-induced apoptosis and decreases the tumorigenic potential of human prostate cancer cells.Oncogene2004 23(2): 386-394

（2014-04-18收稿）

Effects of survivin antisense oligodeoxynecleotides and Oridonin on PC-3 cells

Li Jin1, Yang Luoyan2, Wu Hongtao2
1. Department of Urology, the Central Hospital of Xiangtan, Xiangtan 411100, Hunan, China;
2. Department of Urology, the 2nd Xiangya Hospital, Central South University

Objective To explore the synergistic effects of survivin antisense oligonucleotides combined with Oridonin on growth, apoptosis, and the expression of survivin of PC-3 cells.MethodsHuman prostate carcinoma cells PC-3 on logarithmic growth phase were used in this study. The cell vitality was determined by MTT assay. The combination index (CI) was calculated using Pharmaconamics CalcuSynsoftware. The apoptotic rate was examined by f ow cytometer (FCM). The expression of survivin was detected by Western Blot and Real-time Fluorescent Quantitation-PCR.ResultsAfter transfection with antisense Survivin RNAi, the proliferation of PC-3 cells was inhibited markedly. An obvious apoptosis was found in the transfected PC-3 cells. The inhibitory effect of combined administration of survivin antisense and Oridonin on cell proliferation was much stronger than that of the single way (P<0.01). It showed that there was a synergistic effect (Fa<0.80). Western Blot and RT-PCR assays demonstrated that survivin antisense and Oridonin all inhibited the expression of survivin(P<0.01).ConclusionCombined survivin antisense and Oridonin significantly inhibits cell proliferation, induces cell apoptosis and down-regulates survivin expression in PC-3 cells, indicating that survivin antisense and Oridonin have a synergistic effect on PC-3 cells.

rubescensine; prostatic neoplasms; cell line,tumor; cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.003

R 737.25