PTEN能負調控前列腺癌PC-3細胞Raf-1磷酸化

孫健瑋王劍松*劉子超楊峻峰馬 輝鄭立民

1.昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學院生命科學與技術系; 3.昆明醫科大學第五附屬醫院泌尿外科

PTEN能負調控前列腺癌PC-3細胞Raf-1磷酸化

孫健瑋1王劍松1*劉子超2楊峻峰1馬 輝1鄭立民3

1.昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學院生命科學與技術系; 3.昆明醫科大學第五附屬醫院泌尿外科

目的探討 PTEN基因表達變化對Raf-1磷酸化的影響。方法用Western blot方法分別檢測PTEN基因過表達和干擾后前列腺癌PC-3細胞Raf-1的磷酸化水平。結果PTEN基因過表達后，PC-3細胞的磷酸化Raf-1 減少61.1%；PTEN基因干擾后，磷酸化Raf-1增加75.1%。結論PTEN可負調控前列腺癌PC-3細胞Raf-1的磷酸化。

PTEN磷酸水解酶; Raf激酶類; 前列腺腫瘤

前列腺癌常見于老年男性，其發病率近年來呈明顯上升趨勢。據統計，美國2012年男性新增前列腺癌患者達241 740例，占同期男性全部新增癌癥患者總數的28.5%，位居癌癥新發病率的首位[1]。由于前列腺癌與雄激素相關的特性，激素剝奪性治療（androgen deprivation therapy, ADT）被認為是前列腺癌有效的治療手段[2-4]。但大多數病例最終將發展成為激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer, AIPC）而對內分泌治療產生抵抗，繼而出現復發、轉移和死亡。

第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）屬于抑癌基因，其表達水平降低或丟失與多種腫瘤的發生密切相關[5]。雄激素受體（androgen receptor, AR）是AIPC發生發展進程的關鍵環節之一，并接受多種調控因子的共同作用而產生生物效應[6]。在前列腺癌細胞中，PTEN可以通過負調控PI3K/AKT信號通路影響AR的表達[7,8]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號通路是真核細胞信號轉導網絡的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮十分關鍵的作用。MAPK信號通路由3類蛋白激酶（Raf-MEK-ERK）組成，通過一次磷酸化將上游信號傳遞到下游應答分子。最近有研究證明MAPK信號通路的激活與AIPC的病程進展也存在相關性[9]。然而，PTEN是否與該通路存在關系還不確定。本研究旨在探討PTEN是否與MAPK信號通路中Raf1的磷酸化存在關系，為前列腺癌的臨床診治應用提供理論基礎。

材料與方法

一、材料

前列腺癌PC-3細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫；PTEN-pCMV6載體購自美國Origene公司；si-PTEN RNA購自Qiagen公司；脂質體Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent和Opti-MEM I Medium培養基購自美國Invitrogen公司；兔抗PTEN，山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體購自Santa cruz公司，小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG購自美國KPL公司；胎牛血清購自Gibco公司。

二、細胞培養

細胞培養液為含10%胎牛血清、10 ng/ml EGF和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基，PC-3細胞在37℃，5% CO2恒溫箱培養基培養，2～3d更換培養液，胰酶消化傳代。取對數期細胞用于實驗。

三、細胞的瞬時轉染

在24孔細胞培養板內加入500 ml對數期細胞懸液（1×105個/孔），過夜培養備用。8μg PTEN-pCMV6載體質粒和10μl的Lipofectamine 2000分別用250μl的Opti-MEM稀釋，放置5min后混勻，在室溫放置25min后加入到細胞培養板中，6h后換成完全培養液。轉染48h后用Western Blot檢測PTEN基因過表達程度。并檢測Raf-1的磷酸化水平。用空質粒做對照。

四、細胞的干擾

在24孔細胞培養板內加入500 ml對數期細胞懸液（2×105個/孔），過夜培養備用。0.7μl的20 μM si-PTEN RNA及1μl Lipofectamine RNAiMAX分別用5μl的Opti-MEM稀釋放置5min后混勻，在室溫放置18min后加入到24孔板中并加200μl的opti-MEM，6h后換成含完全培養液。轉染48h后用Western Blot檢測PTEN基因干擾程度。并檢測Raf-1的磷酸化水平。用control siRNA做對照。

五、Western blot檢測

各轉染組細胞用胰酶消化后，加入細胞裂解液裂解并離心提取蛋白質，Bio-rad蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。等量的總蛋白經煮沸變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜，5%奶粉溶液封閉2h，一抗（兔抗PTEN、山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體）孵育過夜，二抗（小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG）孵育4h，滴加適量ECL化學發光底物，顯影。采用Quantity One軟件測定條帶灰度值。實驗重復3次。

六、統計學處理

SPSS13.0統計軟件分析，以均數±標準差表示，兩組數據比較采用配對樣本分析方法，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、過表達PTEN對Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine 2000轉染PTEN-pCMV6載體質粒進入PC-3細胞之后，用Western blot技術測定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測定轉染效果和PTEN過表達對Raf-1磷酸化的影響。結果表明，PTEN過表達后磷酸化Raf-1明顯減少（圖1）。灰度分析表明，過表達后磷酸化Raf-1減少61.1%（表1）。

表1 過表達PTEN對Raf-1影響的Western 條帶灰度值比較（n=3）

圖1 過表達PTEN對Raf-1磷酸化的影響

二、干擾PTEN對Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine RNAiMAX轉染si-PTEN干擾RNA進入PC-3細胞之后，用Western blot技術測定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測定PTEN干擾效果和干擾后對Raf-1磷酸化的影響。結果表明，干擾PTEN后磷酸化Raf-1明顯增加（圖2）。灰度分析表明，干擾PTEN后磷酸化Raf-1增加75.1%（表2）。認與AR異常表達有關。PTEN是一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23，其編碼蛋白具有磷酸酪氨酸酶和雙重特異性磷酸酶結構域，能使某些磷脂或蛋白激酶的相應位點去磷酸化，對細胞周期、細胞凋亡以及細胞的粘附、遷移和分化產生影響[12]。PTEN表達水平降低或丟失與多種腫瘤的發生發展密切相關，PTEN基因的失活是前列腺癌最常見的異常之一[13]。PTEN基因功能的缺失可能是AIPC進展的關鍵原因[14-16]。PTEN功能缺失可阻止PI3K/AKT通路中PIP3脫磷酸轉化為PIP2，從而使AKT持續激活，提高磷酸化AKT水平，繼而調控AR的生物效應，并抑制通路下游凋亡的信號分子，促進細胞的增殖[17]。

MAPK/ERK也是前列腺癌發病機制中的重要信號傳導通路之一。PI3K/AKT信號通路主要與細胞的存活相關，而MAPK/ERK則主要與細胞生長、增殖和分化有關[18,19]。MAPK/ERK信號通路的激活始于細胞膜上的絲裂原受體激活，以高度保守的三級激酶級聯傳遞信號，MAPK以及多種應激原可以不同的啟動機制激活該信號通路。MAPK/ERK信號通路中Raf分為A-raf、B-raf和C-raf-1，其中C-raf-1表達產物為Raf1蛋白激酶，其CR1保守區即為活化Ras的結合部位。Ras作為通路的啟動信號，其激活后可將Raf1聚集到細胞膜并結合其他相關蛋白導致Raf1的磷酸化，磷酸化的Raf1通過其下游因子MAPK激酶（MEK1/2）和細胞外信號調節激酶（ERK1/2）完成胞漿蛋白磷酸化、細胞骨架成分磷酸化以及胞核轉錄因子、核蛋白磷酸化等而實現其生物效應。在前列腺癌，Ras和Raf的激活是自分泌和旁分泌生長因子刺激的結果，Ras持續激活可推進AIPC的病程進展[13]，MAPK/ERK信號通路在前列腺癌的轉移過程中發揮重要的作用[20]。

PTEN是否與MAPK/ERK信號通路存在聯系是本研究想要探討的問題。磷酸化Raf1是MAPK/ ERK信號通路中三級級聯反應的第一級，起著分子開關的作用，是聯系細胞外信號與細胞內激酶級聯反應的關鍵之一。本實驗結果提示PTEN基因表達與前列腺癌PC-3細胞Raf-1磷酸化呈負相關關系，有助于揭示前列腺癌的發生機制并可針對PTEN、Raf1以及MEK等信號通路中關鍵因子作為靶點進行治療干預。PTEN蛋白對Raf1磷酸化的具體作用機制以及磷酸化Raf1對AIPC有何影響，有待進一步研究。

圖2 干擾PTEN對Raf-1磷酸化的影響

表2 干擾PTEN對Raf-1影響的Western條帶灰度值比較（n=3）

討 論

前列腺癌是近年老年男性發病率較高的癌癥之一，對前列腺癌的發病機制及其治療手段研究也是當前癌癥研究領域的熱點。絕大多數早期前列腺癌都與雄激素的異常表達有關，因此，早期前列腺癌治療多用抗雄激素治療的方法[10]。然而，大量前列腺癌后期都表現為激素非依賴性（即AIPC），導致抗雄激素治療無效。

AIPC發病機制尚待研究，AR在其細胞增殖、分化以及發生發展中的重要作用備受關注。作為核轉錄因子，AR結合相關配體可激活一系列活性蛋白轉錄參與細胞的增殖、凋亡等。大多數AIPC表現有AR的擴增或過表達，繼而導致對低水平雄激素的敏感性增加，或經由AR傳遞的信號通路激活，可能是AIPC產生的機制之一[11]。

酪氨酸激酶受體通路是眾多與AR信號通路發生交互作用的信號通路之一，主要包括PI3K/AKT和MAPK/ERK等。其中PI3K/AKT信號通路已經被確

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（2013-11-11收稿）

PTEN downregulates in the level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cell PC-3

Sun Jianwei1, Wang Jiansong1*, Liu zichao2, Yang Junfeng1, Ma Hui1, Zheng Limin3
1.Department of Urology, the Second Affi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China; 2. Department of Biologican Science and Technology, Kunming University; 3. Department of Urology, the Fifth Affi liated Hospital of Kunming Medical University Corresponding author: Wang Jiansong, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the effects of PTEN expression on level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cells.MethodsThe level of Raf-1 phosphorylation was detected by western blot in prostate cancer cells with PTEN gene overexpression or PTEN gene knockdown.ResultsThe level of Raf-1 phosphorylation decreased by 61.1% in PC-3 cells with PTEN gene overexpression, and increased by 75.1% in PC-3 with PTEN gene silence.ConclusionPTEN can downregulate the level of Raf-1 phosphorylation.

PTEN Phosphohydrolase; Raf Kinases; prostatic neoplasms

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.005

R 737.25

*通訊作者, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com