改良法秋水仙素處理技術在染色體畸變分析實驗中應用的比較性研究

陳洋

（惠州市職業病防治院，廣東 惠州 516008）

改良法秋水仙素處理技術在染色體畸變分析實驗中應用的比較性研究

陳洋

（惠州市職業病防治院，廣東 惠州 516008）

目的在染色體畸變分析實驗中，探討與常規方法相比較改良法秋水仙素處理技術的應用價值。方法采取30份樣本，每份標本分成兩份，分別采用A方法(常規法)和B方法（改良法）進行細胞培養和秋水仙素處理。然后均給予細胞收集、離心、固定、制片和染色等步驟。鏡檢計算每種方法的有絲分裂指數。然后利用SPSS 17.0 軟件進行t檢驗分析（P＜0.05時有統計學差異）。結果兩種方法處理后的細胞均生長良好，分裂指數高，均能夠滿足分析要求。兩種方法所得有絲分裂指數比較，無統計學差異（P＞0.05）。結論改良法秋水仙素處理技術具有秋水仙素用量少，毒性低，可控性好等優勢，且實驗效果可靠，具有推廣價值。

改良秋水仙素處理技術；染色體畸變分析

染色體畸變分析是放射工作人員健康監護和慢性小劑量受眾遠期醫學效應評價的重要指標,是最直接反映輻射損傷的檢查項目之一[1,2]。秋水仙素處理是染色體分析實驗中關鍵步驟，常規方法是在細胞培養后加入秋水仙素處理，然后再行收獲、制片和染色[3,4]。本實驗室根據長期的細胞遺傳學工作經驗，改良了秋水仙素處理的方法，采取細胞培養同時進行秋水仙素處理，并取得良好的實驗結果?，F對該實驗方法做如下分析。

表1 30份樣本經兩種方法（A常規法/B改良法）秋水仙素處理后有絲分裂指數比較表(%)

1 材料與方法

1.1 材料

共采取30份樣本（均為肝素抗凝外周全血10 mL）、RPMI1640培養基、秋水仙素（20 μg/mL）、低滲液（為0.075 mol/L氯化鉀）、磷酸鹽緩沖液（由濃度均為1/15 mol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1∶1體積比混合，pH值為6.8）。

1.2 方法

1.2.1 每個樣本分成兩份，分別采用A方法和B方法進行細胞培養和秋水仙素處理。A方法（常規法）秋水仙處理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接種到淋巴細胞培養液中，培養50～54 h后，加入秋水仙素工作液處理3 h（終濃度為0.07 μg/mL）。B方法（改良法）秋水仙處理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接種到己融化好的培養基中，同時加入秋水仙素工作液（終濃度為0.03 μg/mL），將培養基混勻，置于37 ℃恒溫培養箱中，培養50～54 h。

1.2.2 首先收集細胞，將培養基倒入10 mL離心管中，1000 rpm/min離心6 min。棄上清液，加入低滲液8 mL，用滴管輕打混勻，于溫箱中靜置15 min。預固定：加入固定液1 mL，輕輕混勻。以1000 rpm/min離心6 min。固定：棄上清液，加入固定液8 mL混勻，靜置20 min，然后以1000 rpm/min，離心6 min。再次固定，棄上清液，加入6 mL固定液，靜置20 min，然后以1000 rpm/min，離心6 min。棄上清后，依細胞數量多少加入適量固定液，約0.2 mL，備用。

1.2.3 制片：取細胞懸液滴在備用的濕冷玻片上，在酒精燈上過火，寫上編號。

1.2.4 Giemsa染色：Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液，把晾干的載玻片反蓋在上面（細胞面朝下），將制備好的工作液灌滿染色槽，排出氣泡，染色20 min后用自來水沖片，氣干。

1.2.5 鏡檢：在低倍鏡下尋找分散良好，長短適中的分裂相，換用油鏡對其進行細致觀察，每張片計數200個分裂相。計算每種方法的有絲分裂指數。

1.2.6 統計學分析：本實驗數據為計量數據，自身配對實驗設計，利用SPSS 17.0 軟件進行t檢驗（P＜0.05時有統計學差異）。

2 結 果

2.1 制片后鏡下觀察細：鏡下觀察，兩種方法處理后的細胞均生長良好，分裂指數高，能夠滿足分析要求，染色體分散均勻，著色良好，長短適中，兩條姐妹染色體大致平行分離，著絲粒清晰。根據每條染色體的大小和著絲粒的位置，可區分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。如下是制備完成的分散良好的染色體圖片（圖1和圖2）。

圖1 A常規法制片染色后光鏡下所見

圖2 B改良法制片染色后光鏡下所見

2.2 30份樣本經兩種方法（A常規法/B改良法）秋水仙素處理后有絲分裂指數比較表，見表1。經SPSS 17.0 軟件計算后結果，見表2和表3。

表2 成對樣本統計量

表3 成對樣本檢驗

經過統計學運算，P＞0.05，可見兩種方法所得有絲分裂指數比較，無統計學差異。

3 討 論

總所周知，常規法秋水仙素處理已經在染色體畸變研究中得到廣泛的使用，其可靠性毋庸置疑[5]。但由于該方法實驗過程中需要多時間點監控，所以各實驗室在開展該項技術的初期，經常會花費較多時間去摸索實驗條件，故學習曲線較長，不利于實驗技術的推廣。我們實驗室經過長期經驗積累，總結出改良法秋水仙素處理技術，實踐證明效果很好，通過上述實驗數據的統計學分析，我們可以看出，兩種方法在實驗結果方面并沒有明顯的統計學差異，也就是說利用改良法秋水仙素處理可以得到和常規方法相同的實驗結果。

在實踐過程中，我們也可以看到，改良法具有以下幾方面的優勢：①減少秋水仙素的用量和濃度，可以減少秋水仙素的毒性所致的細胞毒作用。秋水仙素使用：我們將秋水仙素于接種時即與標本混合，我們認為這樣的好處首先是接觸充分，利于秋水仙素的作用；其次，由于秋水仙素具有細胞毒性，高濃度其鏡下表現在可見細胞核及細胞質固縮，著色深紫色，細胞轉化率低[6]，培養前混入秋水仙素，可減少秋水仙素的濃度（建議終濃度為0.03 μg/mL）和用量，即減輕其細胞毒作用，是提高實驗效能的關鍵。②操作簡便，單時間點控制，便于學習，利于推廣。實驗方法上我們可以看到常規方法需要控制兩個時間節點，即培養結束加入秋水仙素的時間點和秋水仙素作用時間點，兩個時間點均須嚴格把控，稍有失誤，就會導致實驗失敗。而改良法，只需掌握一個時間節點，即培養結束時間，且由于秋水仙素濃度較低，即便時間稍有延長（＜2 h），也不會影響制片效果，也不會導致實驗失敗。所以改良法更利于學習，利于技術的推廣。

綜上所述，改良法秋水仙素處理技術便于學習，利于推廣，且效果良好，值得推廣。

[1] 李小芳,呂玉民.放射工作人員外周血淋巴細胞染色體畸變和微核分析[J].河南職工醫學院學報,2006,18(5):386-388.

[2] 王喜愛,韓林,王平,等.放射工作人員外周血淋巴細胞微核分析 [J].醫藥論壇雜志,2008,29(4):32.

[3] 肖正華.改良的人體外周血淋巴細胞的培養與染色體標本的制作技術[J].第三軍醫大學學報,1994,16(6):450.

[4] 侯艷香.人外周血淋巴細胞培養染色體制備及影響因素[J].檢驗醫學與臨床,2013,10(7):874.

[5] 任莉萍,李娟,潘亞麗,等.人的外周血淋巴細胞培養及染色體制作技術[J].生物學通報. 2011,46(3):54.

[6] Ranney DF.Suppression of stimulating cell activity by microtubule-disrupting alkaloids[J].J Supramol Struct,1976,5(3): 335-342.

Comparative Analysis of Improved Colchicines Application Method in Chromosome Aberrations Experiment

CHEN Yang

(Huizhou Occupational Disease Prevention Hospital, Huizhou 516008, China)

ObjectiveTo investigate the value of improved colchicines application method in chromosome aberrations experiment,compared with the conventional method.MethodsTo take 30 samples, each sample was divided into two parts, which were cultured and dealed with Method A (conventional method) and Method B (improved method of). The matured cells, which were collected and centrifuged, with discarding the supernatant, were fixed、dyed and observated at low magnification. The mitotic index were calculated.Then t-test was used with SPSS 17.0 for statistical analysis (P＜0.05 means that there are significant differences).ResultThe cells were cultured well in two ways, with high mitotic index, which were able to meet the analytical requirements. The results means that there were no significant difference (P＞0.05).ConclusionImproved colchicines application method had the advantages of less use dosage of colchicines, less toxicity, better controllability, and reliable experimental results, which had promotional value.

Improved colchicines application method; Chromosome aberrations

R-33

B

1671-8194（2014）16-0063-02