低溫下鮮切蓮藕菌相分析及貨架期評價

夏天龍，易 陽，王宏勛*，黃良仟

（武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

鮮切果蔬指經(jīng)過分級、整理、挑選、清洗、切割、保鮮、包裝等處理后保持新鮮狀態(tài)的制品，是可直接烹飪或直接食用的成品果蔬[1-3]。加工過程中，由于切割使得細胞受損，失去了組織的完整性，易受到空氣、加工用水及加工機械中各種微生物的污染[4-5]，微生物的變化成為產(chǎn)品營養(yǎng)、感官品質(zhì)以及安全性下降的主要原因之一[6-10]。在貯藏過程中，受環(huán)境溫度、氧氣含量、包裝材料等方面影響，微生物種類、數(shù)量及變化趨勢也會不同[11-12]。蓮藕具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[13]，真空包裝凈菜蓮藕由于其方便性，已經(jīng)成為蓮藕銷售的新形式。真空包裝能降低氧含量，抑制微生物呼吸作用，延長貨架期。目前對于鮮切果蔬研究主要集中于保鮮劑的篩選、抑制褐變、微生物控制方法、產(chǎn)品開發(fā)等[14-18]，對菌相分析及微生物變化規(guī)律研究較少。以真空包裝鮮切蓮藕為研究對象，對其菌相組成進行初步分析及鑒定，評價微生物變化趨勢與貨架期的關(guān)系，為真空包裝鮮切蓮藕品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮藕（購自武漢如意集團）：選取新鮮、健壯、成熟度適中，藕節(jié)完整，無腐爛變質(zhì)，無機械傷的市售帶泥蓮藕，洗凈去皮后切為片狀（厚度約3mm），真空包裝。

MRS瓊脂培養(yǎng)基、紫紅膽鹽萄葡糖瓊脂培養(yǎng)基（violet red bile dextrose agar，VRBDA）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、革蘭氏染色液、糖醇類發(fā)酵培養(yǎng)基、細菌鑒定管均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（優(yōu)級純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-400B真空包裝機：上海星貝包裝機械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MIR-154型低溫培養(yǎng)箱：三洋電機國際貿(mào)易有限公司；LRH-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；HBM-400系列樣品均質(zhì)器：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；CP214（C）型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；XFS-280A手提式蒸汽不銹鋼滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 鮮切蓮藕菌相分析及變化規(guī)律研究

1.3.1 蓮藕中腐敗微生物生長曲線

將真空包裝的鮮切蓮藕產(chǎn)品恒溫貯藏于4℃低溫培養(yǎng)箱內(nèi)，用MRS、VRBDA、CFC、PDA等選擇性培養(yǎng)基監(jiān)測產(chǎn)品中乳酸菌、腸桿菌、假單胞菌、酵母菌數(shù)量。方法參照GB/T4789.2—2008《食品微生物學檢驗菌落數(shù)測定》[19]。具體的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見表1。

表1 不同微生物的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective medium,culture time and temperature for isolating different bacteria

1.3.2 建立蓮藕中微生物生長模型

運用SAS9.1軟件，用Gompertz[20]模型擬合各微生物生長曲線的數(shù)學模型。Gompertz數(shù)學方程為：lgN（t）=N0+C×exp{-exp[-B（t-M）]}，式中t為時間，d；N0為初始微生物數(shù)量對數(shù)值，lg（CFU/g）；C是微生物穩(wěn)定期數(shù)量與初始值之差，lg（CFU/g）；B是最大生長速率，d-1；M為最大生長速率時所對應(yīng)的時間，即曲線拐點所對應(yīng)的時間，h。

并由上式可計算出微生物生長的延滯期（lag phase，LPD）以及微生物生長的最大比生長速率U。其中，LPD=M-（1/B），d；U=B×C/e，e=2.718 2，d-1。

1.3.3 生長模型驗證

通過準確因子（Af）和偏差因子（Bf）可驗證模型構(gòu)建的準確度[21]。

1.4 腐敗限控量的確定

通過真空包裝鮮切蓮藕的感官可接受度檢測產(chǎn)品貨架期，并確定腐敗菌的腐敗限控量。

參考標準NY/T 1987—2011《鮮切蔬菜》[3]中對鮮切蔬菜感官要求，以包裝指標、色澤、氣味和組織結(jié)構(gòu)為感官指標，建立評定小組進行感官分析，見表2。0分為最好品質(zhì)，4分為商品界限，4分以上為不可接受。

表2 真空包裝鮮切蓮藕感官評價評分表Table 2 Sensory evaluation sheet of vacuum-packed fresh-cut lotus root

1.5 腐敗微生物的分離

從選擇性培養(yǎng)基中選取形態(tài)典型的菌落，采用相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基以平板劃線法進行分離純化，獲得純化菌株。

1.6 腐敗微生物的初步鑒定

1.6.1 菌落形態(tài)觀察

觀察已分離純化的單個菌落的含水狀態(tài)、外觀形態(tài)、透明度、菌落與培養(yǎng)基結(jié)合程度、顏色、菌落正反面顏色的差別、邊緣整齊度、氣味等特征。

1.6.2 個體形態(tài)觀察

挑取菌落進行革蘭氏染色觀察，描述細胞的形狀和細胞間的排列方式，并進行顯微照相。

1.6.3 生理生化試驗

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]對分離純化菌株進行糖醇發(fā)酵試驗、L-精氨酸雙水解酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、尿素酶試驗、硫化氫試驗、蛋白胨水（色氨酸肉湯）發(fā)酵管試驗、Voges-Proskauer（V-P）試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、鄰硝基苯-β-半乳糖苷（ortho-nitrophenyl-β-galactoside，ONPG）試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗微生物分離與鑒定

采用MRS、VRBDA、CFC、PDA等選擇性培養(yǎng)基從蓮藕中分離出乳酸菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬、酵母菌屬各2株。相關(guān)菌落形態(tài)觀察見表3，其顯微結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 腐敗微生物生理生化特征

生理生化試驗結(jié)果見表4。菌株M-1、M-2符合乳酸菌相關(guān)特征，菌株V-1、V-2符合腸桿菌相關(guān)特征，菌株C-1、C-2符合假單胞菌相關(guān)特征，菌株P(guān)-1、P-2符合酵母菌相關(guān)特征。同一科（屬）的兩株微生物的糖醇發(fā)酵、水解酶、脫羧酶、西蒙氏枸櫞酸鹽等鑒定結(jié)果不完全一致，說明2株微生物為同科不同屬，或同屬不同種微生物，這與其顯微結(jié)構(gòu)差異的結(jié)果一致。

表3 鮮切蓮藕中微生物菌落形態(tài)特征Table 3 Microbial colony morphology of vacuum-packed fresh-cut lotus root

圖1 分離的微生物顯微照片F(xiàn)ig.1 Photomicrograph of the isolated microorganisms

表4 鮮切蓮藕中微生物腐敗細菌生理生化試驗結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical properties of the microorganisms in vacuum-packed fresh-cut lotus root

2.3 貯藏過程微生物變化規(guī)律與貨架期

采用選擇性培養(yǎng)基對真空包裝鮮切蓮藕中不同微生物進行平板計數(shù)，監(jiān)測4℃貯藏過程中蓮藕腐敗菌的生長情況。運用Gompertz模型擬合乳酸菌、腸桿菌、假單胞菌、酵母菌生長一級模型，其生長曲線真實值和預(yù)測值由圖2可見。由該模型方程回歸得到酵母菌的生長動力模型、相關(guān)動力學參數(shù)及模型的驗證見表5。

4種微生物的Af、Bf均接近1，其預(yù)測值和真實值之間偏差很小，說明模型能很好地擬合微生物的生長狀況。酵母菌的初始菌落數(shù)最多，且在整個貯藏過程中的數(shù)量有相對優(yōu)勢；腸桿菌和假單胞菌數(shù)量在貯藏初始階段呈現(xiàn)下降，可能是應(yīng)對于貯藏溫度急劇變化的微生物適應(yīng)過程，其繁殖代謝受到一定抑制。乳酸菌延滯期較短；假單胞菌延滯期較長，但最大比生長速率較大；酵母菌與腸桿菌的延滯期及最大比生長速率基本相似。4種微生物的生長動力學參數(shù)差異較小，基本可以判定乳酸菌、酵母菌、腸桿菌、假單胞菌均為真空包裝鮮切蓮藕的主要腐敗菌。

2.4 鮮切蓮藕貯藏期間感官品質(zhì)變化

圖2 4℃腐敗微生物在鮮切蓮藕上的生長擬合曲線Fig.2 Fitting growth curves of microorganisms in fresh-cut lotus root at 4°C

表5 蓮藕中微生物的生長動力學模型和參數(shù)Table 5 Growth kinetics model and parameters of microorganisms isolated from lotus root

圖3 鮮切蓮藕貯藏期間感官質(zhì)量評分Fig.3 Sensory quality score of fresh-cut lotus root during storage

由圖3可知，鮮切蓮藕的感官品質(zhì)隨著貯藏時間的延長不斷下降，且與腐敗微生物的增殖成正相關(guān)。在4℃條件下貯藏10d，各腐敗微生物生長基本達到穩(wěn)定期，蓮藕感官評分為4分，鮮切蓮藕局部褐變，未顯現(xiàn)出可觀察的腐敗現(xiàn)象。10d之后，部分蓮藕切片發(fā)生感官不可接受的褐變及腐敗現(xiàn)象，失去商品價值。通過鮮切蓮藕在貯藏期間的感官品質(zhì)變化確定微生物的限控值為107CFU/g。

3 結(jié)論

通過對真空包裝鮮切蓮藕中菌相組成及其變化趨勢進行研究，發(fā)現(xiàn)鮮切蓮藕中主要優(yōu)勢菌為乳酸菌、腸桿菌、假單胞菌和酵母菌。各微生物數(shù)量均隨著貯藏時間的延長而增加，而蓮藕感官品質(zhì)隨之下降，其中乳酸菌延滯期最短，假單胞菌最大比生長率最高，酵母菌數(shù)量優(yōu)勢相對較大。該蓮藕產(chǎn)品的貨架期為10d左右，所對應(yīng)的微生物數(shù)量級約107CFU/g。后期在研究基于腐敗微生物控制延長鮮切蓮藕貨架期時，應(yīng)該針對多種微生物采取抑菌措施。

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