阿魏酸鈉氯化鈉注射液細菌內毒素檢查法研究

王相忍

（河南省濮陽市食品藥品檢驗所，河南 濮陽 457000）

阿魏酸鈉為非肽類內皮素受體拮抗劑，可拮抗內皮素引起的血管收縮、升壓及血管平滑肌細胞增殖；可增加一氧化氮(NO)的合成，松弛血管平滑肌；抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學特征；抑制膽固醇的合成，調血脂。阿魏酸鈉氯化鈉注射液主要用于動脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病，亦可用于偏頭痛，血管性頭痛的治療。其起效快，對輕、中、重各型患者均有效，是偏頭痛的治本藥物。筆者對阿魏酸鈉氯化鈉注射液細菌內毒素檢查法的可行性進行了探討。

1 儀器、試藥與動物

ZH－2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；TAL－40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）。阿魏酸鈉氯化鈉注射液（河南天方華中藥業有限公司，批號為13032006，12040903，12101701，12101101；福建天泉藥業股份有限公司，批號為12101101；規格均為 100 mL含阿魏酸鈉 0.1 g與氯化鈉0.9 g)；鱟試劑（簡稱 TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號為1301262，規格為 0.1 mL，靈敏度為 0.25 EU /mL；湛江博康海洋生物有限公司，批號為1209030，規格為 0.1 mL，靈敏度為0.25 EU/mL）；細菌內毒素工作標準品（簡稱CSE，中國食品藥品檢定研究院，效價為100 EU/支，批號為150601－201176）；細菌內毒素檢查用水（簡稱BET用水，湛江安度斯生物有限公司，批號為1207310，規格為2 mL）。家兔品種為日本大耳白兔（河南省實驗動物中心提供）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復核

按2010年版《中國藥典（二部）》附錄ⅪE的要求[1]對鱟試劑靈敏度進行了復核，結果見表1。所使用的鱟試劑靈敏度測試值（λc）均在 0.5 ～ 2.0 λ之間，符合規定。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

2.2 供試品細菌內毒素限值（L）的確定

根據公式 L＝K/M，K為每人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑 K＝5 EU/（kg·h），M為每人每千克體重每小時的最大供試品劑量[1]，參照阿魏酸鈉氯化鈉注射液說明書，最大使用劑量為100 mL/h，成人體重按60 kg，則 L＝3 EU/mL。對于體積在100 mL以上（包括100 mL）的復方靜脈輸液類品種，內毒素限值一般按0.5 EU/mL[2]。因此，將本品的 L定為0.5 EU /mL。

2.3 供試品干擾預試驗

目前，國產鱟試劑靈敏度范圍一般在 0.5～0.03 EU /mL，則樣品的最大稀釋倍數（MVD）＝CL/λ＝16。采用不超過最大稀釋倍數的1，2，4，8，16 倍的溶液，記為 NPC；另制備同一系列濃度并含有2 λ細菌內毒素的樣品陽性溶液，記為PPC。用 λ為0.25 EU/mL的兩廠家TAL[2－3]，分別與上述NPC和PPC系列溶液進行反應，每一濃度重復2管，并設陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管。結果見表2。可見，當樣品稀釋2倍時，對兩個廠家TAL均不存在干擾作用。

表2 阿魏酸鈉氯化鈉注射液干擾預試驗結果

2.4 供試品干擾試驗

根據預干擾試驗結果，取2個廠家的4批號樣品制成稀釋2倍的供試品溶液。用供試品溶液和BET用水分別將內毒素工作標準品稀釋成 2，1，0.5，0.25 λ 的系列溶液，然后分別用 λ 為0.25 EU/mL的兩廠家TAL，進行正式干擾試驗[2]。結果見表3。內毒素標準品水溶液反應終點濃度的幾何平均值（ES）均在0.5～2.0 λ范圍內，內毒素供試品溶液反應終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5～2.0 Es范圍內。結果表明，在此試驗條件下，樣品對TAL與細菌內霉素的反應無干擾。

表3 阿魏酸鈉氯化鈉注射液干擾試驗結果

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取4個批號供試品，照預干擾試驗稀釋方法制成稀釋2倍的溶液，用 λ為 0.25 EU/mL 2廠家不同 TAL，以 L為 0.5 EU /mL作為評定標準，按檢查法進行操作和結果判斷。結果見表4。可見，4個批號樣品經不同廠家的TAL檢驗，均符合規定。

表4 阿魏酸鈉氯化鈉注射液細菌內毒素檢查結果

2.6 熱原試驗驗證

取上述4個批號的樣品，進行家兔法（10 mL/kg）熱原檢查試驗，結果均符合規定。

3 討論

現行的質量標準中采用傳統的家兔法檢查熱原，成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低。細菌內毒素檢查法具有較家兔熱原檢查法靈敏、快速、簡便易行、重現性好、結果準確等優點。采用2批不同廠家的鱟試劑對4批樣品進行方法學驗證試驗，結果表明，當樣品稀釋2倍時對鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用，方法學驗證結果也符合細菌內毒素檢查法有效性的規定。建議積累更多的數據后，將該品種的細菌內毒素檢查法（凝膠法）載入國家標準中。

參考文獻:

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄99.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:310.

[3]肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細菌內毒素檢查方法[J].中國醫藥導報，2011，8（32）:159 －161.