輔助降血糖類保健食品非法添加化學物質檢測方法研究

吳楊 張圓 閔春艷 郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇 蘇州 215104）

輔助降血糖類保健食品非法添加化學物質檢測方法研究

吳楊 張圓 閔春艷 郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇 蘇州 215104）

目的：利用超高效液相-串聯四級桿-飛行時間液質聯用系統（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測定輔助降血糖類保健食品中非法添加二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮13種化學藥品的液質聯用檢測方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS檢測，以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18為填充柱；0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸銨水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.3 mL/min；ESI正離子模式，一級、二級質譜全掃描，進行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。結果：此方法經過驗證，線性良好（r＞0.99）、精密度RSD＜3%、樣品回收率在74.1%～ 90.0%之間，檢出限在9.29～ 60.0 ng/mL之間，均能滿足輔助降血糖類保健食品非法添加化學成分篩查的要求。結論：此方法快速、準確、靈敏度高、分離度高，可為輔助降血糖類保健食品非法添加篩查檢測提供有力工具。

超高效液相-串聯四級桿-飛行時間液質聯用系統；輔助降血糖；保健食品；非法添加化學物質

隨著生活水平的提高，人們越來越關注自身的健康狀況，對保健食品的需求逐年增加，但在保健食品中非法添加化學成分的現象目前相當嚴重，嚴重損害了消費者的身心健康和經濟利益，產生的不良反應甚至危及百姓生命。

目前市場上聲稱輔助降血糖類的保健食品常見的添加化學物質主要有：雙胍類降糖藥；磺酰脲類降糖藥（如甲苯磺丁脲及格列奈類）；噻唑烷二酮類降糖藥（如羅格列酮、吡格列酮）等。這些保健食品長期使用會造成病人出現較強的副作用，甚至有死亡的危險。

目前國家食品藥品監督管理總局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件共有 3個文件（批準件編號2009029，2011008，2013001）對降血糖類保健食品和中成藥進行非法添加化學藥品的篩查和驗證，包括 13種化學藥品，共需用 3個液相系統方法，耗時且繁瑣。已有文獻報道[1-5]，篩查的降血糖類化學藥物較少，未能全部覆蓋目前3個系統的全部降血糖類對照品。本實驗擬建立快速、高效、準確篩查降血糖類保健食品非法添加化學物質的方法，在同一系統中完成13種藥物的篩查。利用超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間液質聯用系統（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測定輔助降血糖類保健食品中違法添加二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮13種化學藥品的液質聯用檢測方法，覆蓋現行標準的所有非法添加物質。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國安捷倫公司 1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間液質聯用儀；ML204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；Millipore公司Milli-Q純水儀。

Q-TOF定性軟件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。

PCDL軟件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

1.2 試劑信息

甲醇，MERCK公司，LC-MS級；甲酸，MERCK公司，LC-MS級；乙酸銨，SIGMA-ALDRICH公司，LC-MS級；水為Milli-Q純水儀制去離子水。

1.3 對照品信息

13 種對照品二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮均來自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99%。

1.4 樣品信息

7批樣品均來自于各級食品藥品監督管理局市場抽樣。

2 實驗步驟

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，Rapid Resolution HD，2.1×100 mm，1.8-Micron填料粒徑；DAD（二極管陣列）檢測器，檢測波長230 nm；掃描波長范圍190～ 400 nm，步長（step）：2 nm。流動相：A（0.1%甲酸-10 mmol乙酸銨水溶液）、B（甲醇），流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃。進樣體積：1 μL。洗脫梯度：時間 （min）/B%∶0 min 10%，5 min 55%，13 min 95%，15 min 95%，后運行時間（post runtime）∶2 min。13種宣稱輔助降血糖類非法添加成分的一級提取離子流色譜疊加圖見圖1。

圖1 13種宣稱輔助降血糖類非法添加成分一級提取離子流色譜疊加圖

2.2 質譜條件

電噴霧離子化源（ESI）；毛細管溫度 350℃；干燥氣流量 10 L/min；霧化氣壓力 40 psi；噴霧電壓 3 500 V；破碎電壓（fragmentor）135 V；正離子檢測方式；掃描方式為一級、二級質譜全掃描。二級碎片碰撞能量見表1。

表1 13種輔助降血糖類保健食品非法添加成分相關色譜、質譜信息

2.3 對照品溶液的制備

取二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮對照品各約5 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為單標儲備液。再分別取各單標儲備液1 mL置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含上述各對照品10 μg/mL的混合標樣，供進樣分析。

2.4 供試品溶液的制備

若供試品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細后轉移至10 mL量瓶中，加甲醇約8 mL，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取適量上清液至2 mL離心管，離心5分鐘，取上清液100 μL并用甲醇稀釋至1 mL，即得。

若供試品為液體制劑，精密量取一次服用量，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。量取續濾液適量于2 mL離心管中，離心5分鐘，取上清液100 μL并用甲醇稀釋至1 mL，即得。

2.5 標準譜庫的建立

將13種宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加成分的名稱、分子式、精確相對分子質量以及通過實驗對 13種對照品測得的保留時間、碰撞能量、二級圖譜等信息導入 PDCL Manager（美國Agilent公司）軟件，建立13種非法添加成分標準譜庫，便于檢索和篩查。

3 方法學驗證

按照上述實驗步驟，對方法的專屬性、線性范圍和檢出限、精密度、準確度進行全面考察，結果均符合要求。13種輔助降血糖類保健食品非法添加成分相關色譜、質譜信息見表1。

3.1 檢出限

取13種對照品混標溶液，分別稀釋進樣，按信噪比S/N=3.0計算各化合物的檢出限。13種降血糖類藥物的檢出限見表2。

3.2 標準曲線

取 13種對照品混標溶液，分別稀釋，配制成含13種降血糖類藥物各 0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL的標準曲線工作溶液。13種降血糖類藥物的線性方程和相關系數見表2。根據擬合方程可知，r＞ 0.99，說明瑞格列奈在0.1～ 10 μg/mL范圍內線性良好，另12種降血糖類藥物在0.2～20 μg/mL范圍內線性良好。

表2 13種降血糖類藥物的線性方程、相關系數、檢出限

3.3 精密度

取 2 μg/mL的混標連續進樣 6次，按峰面積計算每種化合物RSD。樣品精密度測定結果見表2。由表可知，此實驗條件的精密度＜3%，說明儀器精密度良好。

3.4 加樣回收率

取陰性樣品5份，平行添加10 μg/mL的混合對照品溶液，按“2.4”項下處理，測定，計算回收率及相對標準偏差（RSD，n=6）加樣回收率在74.1%～90.0%之間，RSD在0.5% ～ 7.1%之間，具體見表2。說明該處理樣品的方法提取效率較高，方法準確度較好。

4 樣品測定及結果

采用“2.4”項下處理并分析7批樣品，設置提取質量窗口為精確相對分子質量 ＜ 20 ppm，保留時間漂移＜0.1 min，根據保留時間、母離子、碎片離子、紫外光譜等信息綜合判斷，確定檢出化合物。結果表明，在7批樣品中，有1批檢出格列本脲，含量為735.0 μg/g。

5 討論

5.1 梯度洗脫條件的建立

由于磺酰脲類降血糖藥（如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列齊特、格列喹酮、瑞格列奈）、雙胍類降血糖藥（如二甲雙胍、苯乙雙胍）和噻唑烷二酮類降血糖藥（如羅格列酮、吡格列酮）極性差異較大，故優化梯度洗脫條件，將三類降血糖藥合并在同一個液相系統中，13個對照品可實現基本分離，峰形良好，專屬性強。

5.2 PCDL譜庫的規范建立

將13種降血糖類非法添加化學成分的名稱、分子式、精確相對分子質量以及通過實驗對13種對照品測得的保留時間、二級圖譜等信息導入PCDL manager軟件，形成譜庫，為以后的降血糖非法添加送檢保健食品的快速檢測提供了便利。

[1] 黃湘鷺，王靜文，曹進，等.降血糖類保健食品中非法添加的8種藥物檢測及實例分析[J].食品科學，2014，35（10）：149-152.

[2] 羅疆南，曹玲，譚力，等.HPLC-MS/MS檢測中藥及保健品中添加的11種降糖類化學藥物[J].中國藥學雜志，2010，45（11）：68-70.

[3] 朱峰，阮麗萍，馬永建，等.超高效液相色譜－串聯質譜聯用法同時檢測降糖類和減肥類保健品中20種非法添加的化學降糖藥物[J].色譜，2014，32（1）：13-20.

[4] 肖樹雄，李楊杰.由降糖中成藥和保健食品檢驗情況探索非法添加化學成分的系統快篩思路[J].藥物分析雜志，2011，31（2）：418-422.

[5] 魏清芳，王嘉林.液相色譜 -串聯四極桿質譜測定中藥及保健品中非法添加 8種化學降糖藥[J].中國藥事，2011，25（1）：70-72.

Study on the Detection Method for Illegally Added Chemicals in Auxiliary Hypoglycemic Health Food

Wu Yang，Zhang Yuan，Min Chunyan，Hao Gang，Gu Bingren
（Suzhou Institute For Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China）

Objective：To establish a fast，accurate and sensitive method for the detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.The chemicals include metformin，buformin，phenformin，tolbutamide，gliclazide，pioglitazone，rosiglitazone，glibornuride，glipizide，repaglinide，glimepiride，glyburide and gliquidone.Methods：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18analysis column was adopted with a mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate （containing 0.1%acetic acid）-methanol using gradient elution，and the flow rate was 0.3 mL/min.ESI＋scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analysis were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results：The method was validated，a linear range was good（r＞0.99）with a precision of RSD ＜3%，the recovery was between 74.1% ～ 90.0%and the limit of detection was between 9.29 ～ 60.0 ng/mL，which can fully meet the screening requirements.Conclusion：This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Auxiliary Hypoglycemic；Health Food；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.10.003

2014-08-19）

蘇州市科學技術局科學計劃項目（SS201220）

吳楊，男，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：973919367@qq.com

顧炳仁，男，碩士生導師，主任藥師。研究方向：藥物分析與管理。通訊作者E-mail：2803307338@qq.com