天七方對H2O2誘導心肌細胞損傷的抗氧化作用研究

劉松濤等

【摘要】目的：研究天七方（TQ）對H2O2所致心肌細胞損傷的抗氧化作用。方法：建立H2O2誘導的心肌損傷模型，通過MTT法觀察在不同濃度天七方的干預下，對心肌細胞增殖作用的影響，采用試劑盒法檢測丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）活力。結果：天七方可明顯抑制H2O2誘導的心肌細胞的凋亡，降低MDA水平，提高SOD，GSH-Px和CAT的活力。結論：天七方通過提高抗氧化酶的活力，抑制H2O2所致的心肌細胞的氧化損傷。

【關鍵詞】天七方；心肌損傷；氧化應激

【中圖分類號】 Q554 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0077-01

隨著人們生活水平的不斷提高，人口平均壽命的延長，缺血性心臟病（又稱冠心病，coronary artery disease，CAD）的發病率不斷上升，已經成為當今世界威脅人類健康的主要疾病之一。越來越多的研究顯示，氧化應激在缺血性心臟病的發生發展過程中扮演了重要的角色，是引起心肌細胞凋亡的主要影響因素之一[1]。氧化應激是指活性氧自由基的產生超過了機體內的清除和/或使用能力，而導致活性氧自由基及其相關代謝產物在體內的過量聚集，從而對機體造成多種損害作用的病理狀態[2]。

中藥復方天七方由紅景天，三七，柴胡和太子參組成，是黑龍江省著名老中醫劉勤教授運用中醫理論，結合幾十年的臨床經驗精心研制并總結出的治療冠心病，心肌缺血的經驗方。本文從分子水平深入闡明天七方抗心肌缺血的作用機制，為其臨床的應用和推廣提供堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD♂乳鼠（24 h），由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2藥物 紅景天、三七、柴胡和太子參，各藥物加水浸泡30 min，先加藥量8倍的水，沸騰后煎40 min，過濾取汁，再加8倍的水，沸騰后煎30 min，合并兩次濾液濃縮并減壓干燥，研制成粉末。

1.3試劑 DMEM細胞培養基（Invitrogen，美國），標準胎牛血清（Gibco，美國），0.25%胰酶消化液（Hyclone，美國），雙抗（Penicillin-Streptomycin Solution，Hyclone，美國）。H2O2（北京化工廠），二甲基亞砜（DMSO，Sigma，美國）。MDA，SOD，GSH-Px和CAT檢測試劑（南京建成生物工程研究所）。

1.4儀器 熒光正置顯微鏡DM4000B（Leica，德國），二氧化碳細胞培養箱Heraeus BB15（Thermo Scientific，美國），超凈工作臺ZHJH-C1115B（上海智成分析儀器制造有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫療設備有限公司），微孔板掃描酶標儀（BioTek insrument，美國），低溫離心機Labofuge 400R（Thermo Electron，德國）。

2實驗方法

2.1 心肌細胞的分離與培養

新生大鼠75%酒精消毒皮膚，迅速開胸，無菌條件下取心室肌，放入PBS液中清洗2～3次，放入無血清的DMEM培養液中，剪成1～1.5 mm3的碎塊，移入離心管中，1000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入0.08%的胰酶置于37℃水浴中，消化6～7次，每次消化10 min。前兩次棄上清，從第3次起收集心肌細胞，過200目篩，1000 r·min-1離心5 min后加入含15%胎牛血清的DMEM培養液制成細胞懸液，在CO2培養箱中培養2 h，以差速分離法去除已貼壁的成纖維細胞，取上清液計數并稀釋細胞密度為1×105個·L-1。接種于96孔板，每孔100 μl，于37℃、CO2培養箱中靜置貼壁培養。每24 h更換1次培養液，48 h后選生長狀態良好的心肌細胞分組處理，進行實驗。

2.2 細胞存活率測定

96孔板接種細胞，單層融合后，每孔加入100μl MTT （1g·L-1 ），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，取出后吸棄培養液，每孔加入100μl DMSO，微樣振蕩器震蕩10 min，于酶標儀570 nm處讀取吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率/% = 各組吸光度值（A） /空白組吸光度值（A） × 100%

2.3 天七方對正常乳鼠心肌細胞的影響

取接種于96孔板培養48 h后的心肌細胞，棄除原培養液，用PBS液洗兩次。正常組每孔加入不含FBS的DEMA培養液100 μl，給藥組每孔加入含天七方終濃度分別為5、10、20 mg·L-1的不含FBS的DEMA培養液100 μl，在孵箱中繼續培養24 h后，MTT法檢測細胞存活率。

2.4 H2O2誘導的心肌細胞損傷模型的建立

取接種于96孔板培養48 h后的心肌細胞，吸棄原培養液，用PBS液洗兩次。正常組每孔加入不含FBS的DMEM培養液100 μl；模型組每孔加入H2O2終濃度分別為50、100、200、400和800μmol·L-1不含FBS的DMEM培養液100 μl，在孵箱中繼續培養5 h后，采用MTT法檢測細胞抑制率。確定建立H2O2損傷模型的最適條件。

2.5 天七方對H2O2損傷心肌細胞保護作用的量效關系研究

取接種于96孔板培養48 h后的心肌細胞，將細胞分成正常組、模型組和天七方組（5、10和20 mg·L-1）。正常對照組每孔加100 μl無血清培養基；模型組，每孔加入不含FBS、含H2O2的DEMA培養液100 μl，終濃度為200 μmol·L-1，放入CO2孵箱，37℃培養；天七方組5、10和20 mg·L-1各劑量組分別預孵4 h后，棄上清，加100μl的200 μmol·L-1H2O2作用5 h后，MTT法檢測細胞存活率。細胞存活率/% = 各組吸光度值（A）/空白組吸光度值（A）×100%。

2.6 天七方對H2O2誘導的心肌細胞損傷中CAT、SOD、和GSH-Px活力和MDA含量的影響

各組處理同“1.3.5”，在6孔板中，消化收集各組細胞，每組加1 ml PBS使細胞重懸，采取反復凍融的方法（-80℃冰箱15 min，室溫20 min，如此重復5次）裂解細胞，進行BCA定量，然后按照試劑盒說明書對細胞裂解液進行SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量的測定。

2.8 統計學分析

實驗數據以X±s表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對t檢驗。

3 結果

3.1 天七方單獨給藥對心肌細胞的影響

結果顯示，天七方各劑量組（5、10和20 mg·L-1）預孵育24 h，與空白組相比，對正常心肌細胞無明顯損傷（p>0.05）。結果如Fig. 1所示。

4討論

在過去的幾十年里，缺血性心臟病的發病率和死亡率呈逐漸上升的趨勢。而由于缺血性心臟病的高危因素如糖尿病、肥胖和吸煙等的普遍流行以及老齡人口的增多更可預示未來缺血性心臟病對人類健康的威脅[3]。雖然目前對于缺血性心臟病的治療如藥物治療及冠脈介入治療等取得了較好的療效，但仍存在一定的問題[4]。藥物治療易產生不良反應，介入治療可導致繼發性損傷，而傳統中藥因其臨床有效性和其可靠的安全性而逐漸得到世界范圍內醫學工作者的認可。

氧化應激誘導的心肌細胞凋亡在缺血性心臟病的發生發展過程中發揮了重要作用[5]。心肌細胞內活性氧自由基在細胞內的異常增多可導致生物大分子的損傷性修飾，而最終通過不同信號途徑導致心肌細胞凋亡性死亡的發生[6-7]。由于心肌細胞是終末分化的細胞，不具備增殖能力，因此心肌細胞的凋亡導致心肌細胞大量丟失，而嚴重影響病人的預后。因此，氧化應激誘導心肌細胞凋亡是缺血性心臟病治療的重要靶點之一。

天七方是臨床應用證實有效的經驗方，由紅景天，三七，柴胡和太子參四味中藥組成。在此方中，紅景天可活血、通脈止痛，三七止血散瘀、消腫止痛，而柴胡和太子參有疏散益氣的功效。在本研究中，H2O2處理顯著增加細胞凋亡性死亡發生的比例，而天七方對H2O2引起的乳鼠心肌細胞凋亡具有明顯的保護作用。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（Programmed cell death），是在完整的細胞膜內經一系列蛋白酶和核酸酶調節的主動的死亡方式。氧化應激通常是指ROS產生和清除的不平衡導致的ROS在細胞內的過量聚集，其可誘導細胞凋亡[8]。細胞具有一套內源性的抗氧化酶類物質用于對抗ROS的可能的損傷作用，其中包括超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。研究顯示提高抗氧化酶的活性可對不同形式的氧化性損傷具有保護作用。本實驗研究結果表明與空白組相比H2O2明顯抑制SOD、CAT和GSH-Px酶活性，導致細胞內ROS不能被及時清除。天七方預處理可明顯增加SOD、CAT和GSH-Px酶活性，提示天七方保護心肌細胞的作用機制是抗氧化作用，這與以往報道的紅景天在缺氧/復氧模型中保護心肌組織中SOD活性，降低MDA含量的結果相一致[9]。此結果說明天七方可能通過增強機體清除氧自由基的能力，減少氧自由基、羥自由基的生成、抑制脂質過氧化從而抑制心肌損傷，這可能是天七方抗氧化應激的重要機制之一。

參考文獻

[2] Pryor WA， Houk KN， Foote CS， et al. Free radical biology and medicine： Its a gas， man！ [J]. Am J Physiol， 2006， 291： R491-511.

[3] Kim NH， Kang PM. Apoptosis in cardiovascular diseases： Mechanism and clinical implications [J]. Korean Circ J， 2010， 40： 299-305.

[5] Lefer DJ and Granger DN. Oxidative stress and cardiac disease [J]. Am J Med， 2000， 109： 315-23.

[6] Ott M， Gogvadze V， Orrenius S， et al. Mitochondria， oxidative stress and cell death [J]. Apoptosis， 2007， 12： 913-22.

[9] 朱寧，張喆，劉莉，陳彥紅，邸雪琴. 紅景天苷對缺氧誘導培養乳鼠心肌細胞的保護作用[J]. 中成藥， 2012， 34（8）：1587-1589.