金釵石斛多糖對高糖誘導的大鼠INS—1細胞胰島素分泌的影響

趙亨 昌智平 張艷磊 唐彥萍

【摘 要】目的：觀察金釵石斛多糖對高糖誘導的大鼠INS-1細胞胰島素分泌能力的影響。方法：將大鼠INS-1細胞分成6組，正常對照組（NC），高糖作用組（HG），羅格列酮組（ROZ），金釵石斛多糖低（LD）、中（MD）、高（HD）濃度干預組。各組藥物作用48h后再用高糖作用1h，提取上清分別觀察胰島素分泌情況。用酶促化學放大發(fā)光法測定各組上清液的胰島素含量。結果：與高糖作用組相比，金釵石斛多糖高、中濃度組細胞的胰島素分泌量明顯增多（P<0.05）。結論：金釵石斛多糖能增加高糖誘導的INS-1細胞的胰島素分泌量。

【關鍵詞】金釵石斛多糖；大鼠；INS-1；胰島素

【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2456-02

Effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells

cultured in high glucose

Zhao heng， Chang zhi-ping， Zhang yanlei，Tang Yan-ping

（Departement of zunyi Medcal College， Gueizhou， Zunyi 563099，China ）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells cultured in high glucose. Methods： We divided into six groups include normal control group （NC）， high glucose control group （HG）， rosiglitazone control group （ROZ）， Dendrobium nobile polysaccharides low dose group （LD）， middle dose group （MD）， high dose group （HD）， and each group was detected by 48hs foster.Then stimulated the cells to secreting insulin by high glucose for 1h， and extracted the supernatant fractions. We measured the insulin levels by chemiluminescence enzyme immunoassay. Results： Dendrobium nobile polysaccharides middle dose and high dose group had higher insulin levels than high glucose control group（P<0.05）. Conclusion： Dendrobium nobile polysaccharides can increase the levels of insulin secreted by rat INS-1 pancreatic cells which cultured in high glucose.

【Keywords】Dendrobium nobile polysaccharides； rat；INS-1； insulin

Ⅰ型糖尿病典型的臨床特征是由于胰島素絕對或相對不足所致的高血糖。胰島素是機體內唯一能降低血糖的激素，也是唯一一種同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。它是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。而高血糖會損害胰島β細胞，研究 [1，2]表明，高血糖對胰島β細胞的損害主要表現(xiàn)在：1、加重胰島素分泌的缺陷和胰島素抵抗（IR）。2、誘導胰島β細胞發(fā)生凋亡。當β細胞凋亡或者分泌功能產(chǎn)生缺陷時，其最直接的表現(xiàn)就是胰島素分泌量的減少。金釵石斛是我國的傳統(tǒng)名貴中藥，具有延年益壽，抗腫瘤，抗衰老和增強抵抗力等作用。李菲等[3]研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖和生物堿對腎上腺素性高血糖小鼠有降血糖作用。同時，本課題組劉圓圓等[4]研究表明，金釵石斛水煎劑對糖尿病腎病大鼠腎臟起到了保護作用。由于大量高純度的β細胞難以獲得，本研究采用大鼠INS-1細胞予以代替。我們主要采用不同濃度的金釵石斛多糖對高糖誘導的INS-1細胞進行藥物干預，觀察其胰島素分泌量的變化，初步判斷金釵石斛多糖的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

金釵石斛（遵義赤水金釵石斛基地提供）；大鼠胰島素瘤細胞INS-1（上海博慧斯公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；DEAE Sepharose Fast Flow（美國GE公司）；馬來酸羅格列酮（天津葛蘭素史克公司）；IMMULITE ?1000（美國SIEMENS公司）；胰島素測定試劑盒（美國SIEMENS公司）。

1.2 方法

1.2.1 金釵石斛多糖提取

采用本課題組張艷磊等[5]的提取方法，先對金釵石斛莖進行脫脂、水提醇沉，然后用sevag法脫蛋白與透析除去小分子物質，最后經(jīng)過陰離子交換柱進行進一步純化。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將INS-1細胞于RPMI-1640培養(yǎng)液（含11.1 mmol/l 葡萄糖，10%FBS，50μmol/l 2-巰基乙醇，1 mmol/l丙酮酸，10 mmol/l HEPES）中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組

實驗分成6組：NC組（含11.1 mmol/l葡萄糖的普通培養(yǎng)液），HG組（含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培養(yǎng)液），ROZ組（高糖培養(yǎng)液+80μmol/l的羅格列酮），LD組（高糖培養(yǎng)液+0.04μg/ml的金釵石斛多糖），MD組（高糖培養(yǎng)液+0.4μg/ml的金釵石斛多糖），HD組（高糖培養(yǎng)液+4μg/ml的金釵石斛多糖）。INS-1細胞在普通培養(yǎng)液漲到80%～90%時，加入含0.5%FBS的普通培養(yǎng)液同步化24h。到時間后，按各分組加入不同的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。

1.2.4 胰島素分泌量測定

INS-1在含不同成分的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后，除去培養(yǎng)瓶中上清。在各培養(yǎng)瓶中重新加入含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培養(yǎng)液，并孵育1h。收集上清液，用酶促化學放大發(fā)光法測定胰島素含量，每組重復3次。

2 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行處理，實驗結果以均數(shù)±標準差（ ± s）表示。采用Duncan-t檢驗，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 多糖提取結果

利用DEAE Sepharose Fast Flow分離純化后，得到中性多糖成分，其多糖含量為98.1%，研究認為結果可靠，可用于后續(xù)實驗[5]。

3.2 胰島素分泌量測定結果

4 討論

糖尿病是高血糖癥、高脂血癥、胰島淀粉樣物質的沉積等因素的聯(lián)合作用，使機體的內環(huán)境穩(wěn)定性逐漸破壞，引起各種慢性并發(fā)癥[1]。胰島β細胞的功能障礙和凋亡與Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的發(fā)病都密切相關[6]，其中一個直接表現(xiàn)就是胰島素的分泌大量減少。本實驗結果也顯示，與正常對照組相比，高糖作用組能顯著抑制胰島素的分泌（P<0.05）。中藥治療糖尿病的機制包括：抑制α-糖苷酶、胰島素樣作用、修復β細胞增加胰島素的分泌、減少胰高血糖素的分泌、提高機體對胰島素的敏感性.本研究結果顯示，與高糖組相比，金釵石斛多糖低、中、高濃度組能在不同程度上增加胰島素的分泌量（P<0.05）。這個結果提示，金釵石斛多糖可能在一定程度上能減少高糖作用下β細胞的凋亡和（或）恢復其胰島素分泌功能。或許金釵石斛多糖能以此為基礎在一定程度上減輕糖尿病患者的各方面癥狀。雖然這3組不同濃度的金釵石斛多糖在與ROZ組相比時，效果沒羅格列酮明顯（P<0.05）。但是，羅格列酮有一定的副作用，陳忻等[7]發(fā)現(xiàn)羅格列酮會增加65歲以上糖尿病患者患心血管病的風險。而金釵石斛多糖作為一種中藥提取物，目前尚未發(fā)現(xiàn)其對人體的副作用。總之，金釵石斛多糖能夠增加高糖誘導下INS-1細胞的胰島素分泌，并且無副作用，在糖尿病治療的研究中應對其多加開發(fā)利用。

近年來，對胰島素分泌的研究主要集中在它的幾個轉錄因子上，其中比較重要的有MafA、Pdx1和Beta2[8].這3個基因共同調控著胰島素基因的轉錄。近來又有學者提出，其中的MafA是β細胞功能完善的關鍵基因，但具體過程尚未了解[9]。那么，金釵石斛多糖能否在基因水平上影響β細胞的胰島素分泌呢？本人對這方面的研究探索也已開展。繼續(xù)深入的研究，有助于開發(fā)金釵石斛的藥用價值，并且可能為糖尿病的治療提供新靶點。

參考文獻：

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[7] 陳忻， 楊麗， 翟所迪. 羅格列酮和吡格列酮對 65 歲以上糖尿病患者心血管事件風險的 meta 分析[J]. 藥物不良反應雜志， 2011， 13（2）： 73-77.

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基金項目：

貴州省衛(wèi)生廳科學技術基金項目（No：gzwkj2013-1-064）。

通信作者：

唐彥萍（1953-），女，教授，研究方向：藥物分子生物學，E-mail：tiantian8609445 @163.com