馬蹄蓮遠緣雜交及其白化后代的胚拯救

商雨等

摘 要 以昆明地區傳統栽培的白花馬蹄蓮和彩色馬蹄蓮Ym035（橙紅復色）、Ym005（紅色）、Ym088（金黃色）、Ym002（淺粉色）和Ym064（紫紅色）為試驗材料，進行遠緣雜交，對雜交組合和結實率進行分析，探索遠緣雜交的親和性；設計4組不同激素組合，對雜交白化苗后代幼胚進行胚拯救，探索最適于白化苗幼胚萌發的激素配比。結果表明，彩色馬蹄蓮做母本，結實率高于白花馬蹄蓮，白花馬蹄蓮地栽植株比盆栽的更為健壯，最佳組間雜交組合為：Ym002×白花馬蹄蓮（地栽），彩色馬蹄蓮組內雜交以Ym005×Ym035雜交親和性較高；遠緣雜交白化苗后代幼胚萌發的最適培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關鍵詞 馬蹄蓮；遠緣雜交；白化苗；胚拯救

中圖分類號 S682.2 文獻標識碼 A

Abstract The cultivars of colored Zantedeschia hybrid： Ym035， Ym005， Ym088， Ym002，Ym064 and Zantedeschia aethiopica were used as the experimental materials. The setting rate of seeds was analyzed to find the best crossing combinations. Albino hybrids between Z. aethiopica and colored Z. hybrid were obtained by embryo rescue. Four different media were designed to explore the best one for embryo rescue. The results showed： the colored Z. hybrid was better as female parent than Z. aethiopica， and the best crossing combination was Ym002 × Z. aethiopic. Z. aethiopic planted in the ground was more vigorous than that planted in the pots. For the crossings in the Aestivae section， the combination of Ym005 × Ym035 had a higher affinity. MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L was the best media for embryo rescue of the albino hybrids from intersection hybridization.

Key words Zantedeschia spp.； Interspecific crossing； Albino seedling； Embryo rescue

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.002

馬蹄蓮（Zantedeschia spp.）為天南星科（Araceae）、馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉。馬蹄蓮屬包括兩個組：Zantedeschia組和Aestivae組。Zantedeschia組莖葉原產地冬季不落葉，具有長形、有分支的地下莖，花為白色，被稱為白花馬蹄蓮[1]。Aestivae組莖葉冬季枯萎、種球具有冬季休眠的特點，佛焰苞彩色，稱為彩色馬蹄蓮[2]。馬蹄蓮，尤其是彩色馬蹄蓮，花型獨特、色彩艷麗、花葉具賞，不但是極好的切花素材，盆花也受到消費者的廣泛喜愛，被譽為21世紀“花卉之星”。

彩色馬蹄蓮雖然具有較高的觀賞價值和較好的市場前景，但由于其自身極易感染由歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，現改名為Pectobacterium carotovora subsp. carotovora胡蘿卜軟腐果膠桿菌）引起的細菌性軟腐病而導致大面積死亡[3]，加之目前主要依賴進口的彩色馬蹄蓮種球價格昂貴，導致彩色馬蹄蓮難以推廣種植，極大的限制了彩色馬蹄蓮的發展。與彩色馬蹄蓮不同，白花馬蹄蓮對歐文氏軟腐細菌天生具有高抗性[4]。但由于核質不相容障礙（Plastome-genome incompatibility，PGI），白花馬蹄蓮和彩色馬蹄蓮種間雜交得到的均為白化苗[5]，限制了白花馬蹄蓮的抗性基因滲入到彩色馬蹄蓮中。因此研究馬蹄蓮PGI障礙所導致的種間雜交后代白化機制，可以為克服彩色馬蹄蓮細菌性軟腐病提供新的思路。

已經有許多被子植物被報道有核質不相容障礙，其中以馬蹄蓮[6]、月莧草[7]、杜鵑[8]中發生的最為普遍。白化是植物育種，特別是遠緣雜交中常見的現象[9]。Yao等[10]曾經對馬蹄蓮白化苗進行抗病性檢測，從中篩選異養條件下的抗性雜種。遠緣雜交對創造更為豐富的遺傳變異提供了可能性，國內馬蹄蓮的雜交育種研究，多集中于組內雜交，組間遠緣雜交、雜交親和性研究尚未見報道。雜交后代敗育是遠緣雜交育種難以進行的主要障礙之一[11]。由于缺乏葉綠素，白化后代不能進行光合作用，往往于種子萌發幾天之后死亡。利用胚拯救技術成功獲得離體白化苗，是研究白化苗特性和白化機制的重要基礎。利用胚拯救技術可以使原本不能正常結實的雜交組合獲得后代。胚拯救技術目前較常用于果樹栽培方面的研究，馬蹄蓮由于雜交后代常敗育，也較常使用胚拯救技術獲得大量材料[12]。

本試驗以白花馬蹄蓮和5個不同彩色馬蹄蓮品種為親本，進行遠緣雜交，探索馬蹄蓮遠緣雜交親和性；運用胚拯救技術成功獲得雜交后代的同時，探索白化后代幼胚離體生長的適宜培養基配方，為馬蹄蓮遠緣雜交育種及PGI障礙導致的種間雜交后代白化機制的研究提供試驗材料和技術支持，從而為進一步的育種目標——培育馬蹄蓮抗病新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白花馬蹄蓮為昆明地區傳統栽培的白花馬蹄蓮品種，彩色馬蹄蓮品種主要由亞歐園藝花卉公司提供，其中除馬蹄蓮白花（地栽組）為地栽外，其它所有材料均為盆栽，所有彩色馬蹄蓮品種均為市場流行的栽培品種，且前期試驗表明自交結實率較高。

1.1.2 主要儀器和試劑 解剖刀、育種專用套袋、酒精燈、超凈工作臺、鑷子、燒杯、玻棒等玻璃試劑儀器。MS培養基所需試劑、6-BA、NAA、75%酒精、2% NaClO、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 去雄 當馬蹄蓮雌蕊柱頭略有突起，開始分泌少量黏液時去雄。用蘸過75%酒精的解剖刀將整個肉穗花序上的雄蕊切除，并將切除的雄蕊置于玻璃培養皿中。在干燥情況下，2～3 d后雄蕊會分泌花粉。對分泌的花粉進行收集，一般干燥條件下，花粉活力可以維持7 d，但最好不超過5 d進行雜交授粉。

1.2.2 雜交 去除雄蕊的馬蹄蓮2～3 d后，雌蕊開始分泌黏液，此時進行雜交。醫用棉棒蘸取適量花粉，均勻的涂抹在雌蕊柱頭上，使柱頭的每個突起均有花粉黏液。試驗主要進行兩類，一類是馬蹄蓮白花組和彩色組雜交，需在白花馬蹄蓮柱頭涂抹彩色馬蹄蓮花粉，彩色馬蹄蓮柱頭涂抹白花馬蹄蓮花粉，將6個不同品種分為8組，每組均設正反交實驗，共16個雜交組合（Ym005由于品種數量不夠，沒有加入組間雜交試驗）；另一類是馬蹄蓮彩色組間雜交，選取不同品種彩色馬蹄蓮進行雜交，并注意正反交5個不同彩色馬蹄蓮品種共20個雜交組合。具體雜交情況見表1、表2。雜交授粉結束后，用育種袋對花朵進行套袋處理，防止其他花粉的干擾。一般授粉兩周后，果實開始膨大，60 d后可以開始采摘進行下一步試驗。

1.2.3 胚拯救 試驗材料為馬蹄蓮組內雜交后代果實，彩色馬蹄蓮組間雜交未產生白化苗，本試驗僅采用白化苗后代作胚拯救材料。將果實采收后，用洗衣粉清洗干凈，蒸餾水中浸泡30 min后置于超凈工作臺內。無菌條件下，75%的酒精浸泡約30 s，取出后放于2%的NaClO中消毒10 min左右。消毒結束后，無菌水清洗3遍，將果實表面擦拭酒精，在酒精燈上灼燒約30 s，至果實表面子房微微皺縮即可。

外植體消毒結束后，小心取出包裹于子房內的胚珠，再用手術刀輕輕剝離珠被，注意不要傷害到幼胚。去除珠被后，可將幼胚置于培養皿中，幼胚褐色生長點必須向上。本試驗培養基配方總共有4種，每種培養基接種25瓶，每瓶接種幼胚2個。具體配方及萌發情況見表3。

上述培養基均在普通MS培養基基礎上，添加蔗糖30 g，瓊脂粉6.3 g。接種后置于溫度25 ℃，光照40 μmol/（m2·s）的培養室內培養。

2 結果與分析

2.1 雜交親和性及結實情況

2.1.1 馬蹄蓮組間雜交不同母本類型結實率差異

不同組別正反交結實情況見圖1，不同母本類型總體結實率情況見圖2。由圖1、圖2可以看出，白花組作為母本的雜交組合，結實情況不如彩色組為母本。除F組外，其余組別彩色馬蹄蓮為母本時的親和性均比白花馬蹄蓮為母本時好。以白花馬蹄蓮為母本的雜交組合，總結實率為17.5%，而以彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合總結實率高達25.6%。兩者之間差異顯著。雜交進行14 d后，彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合開始出現雌蕊膨大現象，白花馬蹄蓮作為母本的雜交組合20 d以后膨大。白花馬蹄蓮為母本的雜交組合，雜交后50 d即可進行胚拯救，彩色馬蹄蓮胚拯救的最佳時期則需要60～70 d，不同成熟時間不會影響胚拯救結實率。

2.1.2 栽培方式對白花馬蹄蓮雜交結實率的影響

白花組做母本的雜交組合，不同栽培方式的結實率有較大差異（圖3）。

以白花（盆栽）作為母本的雜交組合大多敗育，結實率只有11.8%。而以白花（地栽）作為母本的雜交組合結實情況相對較好，結實率有20%。

2.1.3 組間雜交彩色組做母本品種間結實差異

彩色馬蹄蓮做母本，不同雜交組合間的結實情況見圖4。

以彩色馬蹄蓮作為母本的雜交組合，結實率都比較好，Ym002作母本結實率最高。橙紅復色品種Ym035為母本的雜交組合中，早期膨大明顯，但后期多敗育。Ym088純正金黃色的品種，大部分由于軟腐病而未結實。Ym002是花色接近白色的粉白色品種，結實率最高。Ym064為深紫色馬蹄蓮品種，所結果實比其他品種大，便于后期胚拯救的操作。

2.1.4 彩色馬蹄蓮組內雜交母本結實情況 彩色馬蹄蓮組內雜交其母本結實情況見圖5。

在進行彩色馬蹄蓮組內雜交試驗過程中，各雜交組合之間結實率差異較大。Ym005與橙紅復色的Ym035為母本，結實率最高，分別為61.3%和41.4%。Ym005品種資源較少，已逐漸退出市場，Ym035結實率高主要是由于品種粗壯，不易感染軟腐病。而Ym088是最容易感染軟腐病的品種，其結實率只有17.4%。Ym064和Ym002為母本的雜交組合，結實率分別為21.6%和28.6%。

2.2 不同激素對雜交幼胚萌發的影響

在選擇的4種不同的激素水平中，對比6-BA含量不同，NAA含量相同的Ⅰ、Ⅳ組和Ⅱ、Ⅲ組發現，6-BA量的多少對幼胚的萌發起著關鍵作用，6-BA含量為1.0 mg/L的培養基萌發率顯著多于0.5 mg/L。從NAA含量不同，6-BA含量相同的Ⅰ、Ⅲ組和Ⅱ、Ⅳ組可以看出，NAA含量增加從一定程度上增大幼胚的萌發率，但效果沒有6-BA明顯。萌發率最高的培養基配方為6-BA添加1.0 mg/L，NAA添加0.1 mg/L，萌發率高達74%（表3）。

幼胚接種后大約14 d開始萌發，白花馬蹄蓮為母本的幼胚萌發時間比彩色馬蹄蓮為母本稍早。萌發約80 d后，可以進行正常轉接。為了轉接后植株的生長，培養基可適當增加6-BA的含量。離體培養3代后，馬蹄蓮白化苗數量見表4。

3 討論與結論

3.1 馬蹄蓮雜交親和性的不同

研究結果表明，在相同條件下，彩色馬蹄蓮作為母本雜交親和性高于白花馬蹄蓮。同一雜交親本不同正反交試驗中，除Ym088外，其余彩色馬蹄蓮品種做母本結實率均高于白花馬蹄蓮，說明彩色馬蹄蓮相較于白花馬蹄蓮，雌蕊的生長活性更強。這可能是由于供試的幾個彩色馬蹄蓮品種均為經過多次改良、自交結實率高的品種。

彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合都有較好的結實率，以Ym002為母本的結實率最高。Ym002為最接近白色的粉白色品種，與白花馬蹄蓮親緣關系較近可能是雜交結實率相對較好的原因。Ym088植株較易感染軟腐病，不建議作為馬蹄蓮白化苗的母本選擇。Ym035抗病能力最強，但試驗中頻繁出現授粉初期雌蕊膨大較為明顯，但后期不繼續發育的現象。可能是由于花粉只與卵核或極核發生單受精所致[13]。另外，即使在使用進口盆栽基質的情況下，地栽白花馬蹄蓮的結實情況還是遠好于盆栽白花馬蹄蓮，可能是白花馬蹄蓮根系發達，地栽條件為其提供了充分的生長空間。

顏色也是彩色馬蹄蓮原種分類的主要依據之一[14]，本試驗選擇不同顏色的彩色馬蹄蓮作親本，所有雜交組合中未產生完全白化苗。說明彩色馬蹄蓮栽培品種經過多次組合雜交后，聚合了多個親本的基因，已無法從顏色判斷其遺傳組成、將其作為雜交親本組合的依據。尋找更好的鑒別方法，如現代分子標記技術等，將是促進馬蹄蓮育種的有效方法。彩色馬蹄蓮組內雜交，粉色的Ym002和具有相對較好抗軟腐病能力的Ym064雜交親和性較差；Ym005品種具有較高的雜交親和性；Ym035作為市場的新寵，也有較高的雜交親和性。

3.2 不同激素對白化苗幼胚萌發率的影響

不同激素對白化苗幼胚離體培養的效果影響很大。通過試驗表明，在MS培養基中附加1.0 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的NAA最適宜白化苗幼胚萌發，6-BA對白化苗幼胚培養萌發率的影響要遠高于NAA，試驗結果與彩色馬蹄蓮胚拯救[12]結果相似。但關于更多激素種類及濃度對白化苗生長的影響還需進一步試驗探索。

胚拯救技術在外源供給營養的條件下，使不能自養的白化苗在較短時間內迅速擴繁，數量增加90多倍。試驗結果表明，外源供給營養的條件下，馬蹄蓮白化苗的生長速度與分化情況與普通綠色苗無明顯差異，這一發現為PGI障礙導致的馬蹄蓮遠緣雜交后代白化機制的認識提供了重要啟示，胚拯救技術獲得了離體培養的白化苗，不但為其白化分子機制的研究提供了材料，也對克服馬蹄蓮核質不親和障礙進而創造兼具抗性和觀賞性的新品種具有重要意義。

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