甘蔗屬熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代花粉母細胞減數分裂及花粉敗育研究

摘 要 采用染色體壓片法研究甘蔗屬熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代花粉母細胞減數分裂過程及染色體行為，顯微觀察結果顯示：在終變期觀察到單價體、二價體和四價體；分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ、中期Ⅱ和后期Ⅱ均出現落后染色體；中期Ⅱ形成“八”字形紡錘絲、后期Ⅱ二分體2個子細胞染色體不同步分離；四分體時期觀察到三分體、微核、大小不等的四分體以及多面體等異常細胞；同一小花的3個花藥中幾個不同時期的分裂相同時存在。進一步應用DAPI熒光染料進行染色觀察，結果表明，大多數小孢子在單核時期就發生皺縮變形。該結果說明減數分裂過程異常染色體行為和異常細胞分裂是導致雜交F1代花粉完全敗育的主要原因?；ǚ蹟∮龝r期為小孢子母細胞時期、四分體時期和單核小孢子時期。

關鍵詞 甘蔗；滇蔗茅；雜交F1代；花粉敗育；減數分裂

中圖分類號 Q23 文獻標識碼 A

Abstract The cytological smear techniques was used for studing the meiosis and chromosome behavior of pollen mother cells in Sugarcane officinarum × Erianthus rockii F1 hybrids. The results from microscope observation revealed some abnormal behaviors in meiosis as follows： ①The univalents， bivalents and quadrivalents were observed in diakinesis； ②A few lagging chromosomes appeared in metaphase Ⅰ， anaphase Ⅰ， metaphase Ⅱ and anaphase Ⅱ； ③The back arch shaped spindle in metaphase Ⅱ and the Daughter cell chromosomes in dyad were out of sync separation in anaphase Ⅱ； ④There were some abnormal cells in tetrad stage， such as traid， micronucleus， different sized tetrad and polyhedron etc； ⑤Different cell division phase co-existed in the three anthers in one flower. Another results from DAPI staining method indicated that most microspores came into shrinkage deformation in the uninucleate stage. Ultimately， it can be concluded that the chromosome abnormal behavior and the cell abnormal division in meiosis should be the main reason for the pollen abortion completely of F1 hybrids， and the pollens abortion couble be occurred in the stage of microspore mother cell， tetrads and uninucleate microspore.

Key words Sugarcane； Erianthus rockii； F1 hybrid； Pollen abortion； Meiosis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.020

甘蔗是中國乃至世界最重要的糖料作物[1]。甘蔗屬包括了熱帶種（Saccharum officinarum）、中國種（S. sinense）、印度種（S. barberi）、細莖野生種（S. spontaneum）和大莖野生種（S. robustum）等。甘蔗屬染色體極為復雜（具高度多倍體化且為非整倍體），該屬成員含2n=40～200和現代栽培品種100～130條染色體[2-3]。甘蔗存在不規則的減數分裂類型，這種不規則的減數分裂有助于形成非整倍體配子，染色體大部分以二價體進行配對[2，4]。甘蔗屬熱帶種是蔗糖分的主要基因來源，典型的熱帶種染色體數目2n=80，其減數分裂存在下述情形：某些帶有規則二價體的無性系能夠進行正常的減數分裂；有的有較低頻度的減數分裂異常體（例如出現少量單價體）；有的在減數分裂時出現相當高量的異常體，例如常出現單價體、落后染色體、橋體和紡錘體異常[5]。在甘蔗育種上常以熱帶種為主體親本與其他種尤其是細莖野生種和印度種雜交，產生的后代經過數次回交或雜交獲得現代甘蔗栽培品種，用于蔗糖加工生產。但因甘蔗各類型種質不易開花，花期差異大，能作親本利用的材料較少，長期的近親雜交導致現代甘蔗品種的遺傳基礎狹窄，從而限制了品種生產力的進一步提高[6]。利用甘蔗與野生種進行遠緣雜交是甘蔗品種改良和種質創新的重要途徑之一[7-9]，通過不斷創新種質期望能選育出突破性新品種。

滇蔗茅（Erianthus rockii Keng）屬于蔗茅屬，是甘蔗屬的近緣植物資源，在中國主要產于四川、云南、西藏；多生于海拔500～2 700 m的干燥山坡草地[10]。目前國家甘蔗種質資源圃（云南省開遠市）保存有50多份滇蔗茅資源，蔡青等的研究結果表明，滇蔗茅與甘蔗親緣關系較近[11-12]，滇蔗茅種間遺傳多樣性非常豐富[13]，同時具有抗銹病強的優良特性[14-15]，已成為甘蔗育種工作者理想的抗銹病親本。20世紀90年代，廣西甘蔗研究所開始對滇蔗茅進行遠緣雜交利用[16-17]，但至今還沒有創制出高世代的含滇蔗茅血緣材料。近年，云南甘蔗研究所通過光周期室調控技術誘導優質的甘蔗屬熱帶種孕穗開花，與近緣屬種滇蔗茅進行遠緣雜交利用，獲得雜交F1和BC1代植株[18-20]，并且采用先進的分子標記技術對雜交后代進行真實性鑒定[21-22]。林秀琴等對滇蔗茅及其雜交F1代染色體進行分析，結果表明，滇蔗茅體細胞染色體數目2n=30[23]，當與熱帶種雜交時，雙親本染色體以n+n方式進行遺傳[24-25]。但是，滇蔗茅與熱帶種遠緣雜交F1代植株花粉高度不育，其機理還不清楚，導致雜交F1代用作父本去改良現有甘蔗品種的難度較大，極大地阻礙了滇蔗茅種質資源優異性狀的挖掘利用。為了探討雜交F1代花粉敗育的原因，本文采用染色體壓片方法對8個雜交F1代花粉母細胞減數分裂過程進行顯微觀察，較詳細地分析了花粉母細胞減數分裂過程各時期的細胞學特征，進一步采用DAPI熒光染料對花粉粒細胞核進行染色觀察，以判斷雜交F1代植株花粉敗育的時期。

1 材料與方法

1.1 材料

以甘蔗屬熱帶種（路打士）和蔗茅屬滇蔗茅（云南95-19）的雜交F1代為實驗材料，材料經SSR分子標記鑒定均為真實的雜交后代[21]，該材料由國家甘蔗種質資源圃提供。

1.2 方法

1.2.1 取樣及預處理 在材料孕穗的中后期適時取樣，選取幼穗上、中、下部位的小花進行混合，用卡諾氏固定液Ⅰ固定24 h（4 ℃冰箱中），雙蒸水洗2次，每次10 min，轉入70%酒精4 ℃冰箱中長期保存，用于后面花粉母細胞減數分裂過程制片和DAPI染色觀察。

1.2.2 制片方法與普通細胞學分析 采用染色體壓片法進行制片，將小花從70%乙醇中取出，用濾紙吸干溶液后放在一干凈的載玻片上，用解剖針將花藥挑出，滴1滴改良苯酚卡寶品紅染色液，迅速用鑷子將花藥壁搗碎，使花粉母細胞溢出，除去花藥壁和組織殘渣，加蓋玻片，輕輕敲片，壓片，用濾紙吸掉多余的染色液，在蔡司Axioskop 2 plus顯微鏡下觀察各時期分裂相并拍照。根據Sapra等[26]的方法來統計其減數分裂指數，即減數分裂指數=（末期Ⅱ（四分體）的正常細胞數/末期Ⅱ觀察細胞總數）×100，減數分裂指數為90～100代表遺傳穩定。

1.2.3 DAPI熒光染料染色觀察 取相對成熟的花藥放在一干凈的載玻片上，用解剖針將其搗碎，滴1滴DAPI溶液（2 μg/mL），避光染色7 min，再滴1滴抗熒光衰減劑進行封片，在蔡司熒光顯微鏡下觀察小孢子發育狀況。

1.2.4 花粉育性觀察 在田間取成熟的花粉帶回實驗室，用1%碘一碘化鉀染色液進行染色，然后在顯微鏡下觀察，每個材料觀察5個視野，每個材料至少觀察200個成熟花粉粒，統計可育花粉和不育花粉的數目?；ǚ鄢蕡A形且染色深的為可育花粉，反之染色淺的或形狀不規則的為不育花粉。

2 結果與分析

2.1 雜交F1代花粉母細胞減數分裂觀察結果

2.1.1 前期Ⅰ 在減數分裂前期Ⅰ的細線期，染色體呈細線狀，具有念珠狀的染色粒。染色體細線交織在一起成團，偏向核的一方，DNA復制完成，核仁清晰可見（圖1-A）。偶線期同源染色體開始配對重組（圖1-B）。至粗線期，核仁仍然可見，染色體逐漸縮短變粗，同源染色體配對及遺傳物質交換完成（圖1-C）。雙線期的染色體進一步濃縮，可見交叉結和交叉端化（圖1-D、E）。終變期可識別染色體構型，染色體構型以棒狀為主，此時還觀察到單價體、雙價體和四價體（圖1-F；圖2-A、B）。

2.1.2 中期Ⅰ～末期Ⅰ 減數分裂中期Ⅰ，染色體密集地排列在赤道板上，由于染色體小、數目多，此時的染色體構型比較難判斷（圖1-G）。在中期Ⅰ細胞中觀察到散落在赤道板外的單價體和二價體（圖2-C、D），形成中期Ⅰ落后染色體，這種異常細胞的比例約占35%。同時，在后期Ⅰ和末期Ⅰ，均觀察到落后染色體（圖2-E、F、G），可能是由于中期Ⅰ落后染色體繼續落后，且在每個細胞中落后染色體的數目均較多。后期Ⅰ和末期Ⅰ出現落后染色體的頻率約為53%。末期Ⅰ還觀察到染色體粘黏現象（圖2-F、G）。

2.1.3 二分體 在末期Ⅰ染色體移到兩級后開始松散變細，逐漸形成2個子核；同時細胞質分為兩部分，于是形成2個子細胞，稱為二分體。二分體停留時間很短，在末期Ⅰ后僅接著就進入下一次分裂。在二分體時期觀察到核外染色體及二分體大小不一樣等異?，F象（圖2-H、I）。

2.1.4 中期Ⅱ 在減數分裂中期Ⅱ，2個剛分離的子細胞并列在一起，二分體的染色體在紡錘絲的牽引下排列在2個子細胞的中央（圖1-I）。中期Ⅱ紡錘絲多為“平行紡錘絲”，僅觀察到1個細胞形成“八字形紡錘絲”（圖3-A），沒有觀察到“垂直紡錘絲”。中期Ⅱ仍觀察到一些散落在赤道板外的染色體（圖3-B），出現頻率約為56%。

2.1.5 后期Ⅱ 觀察到二分體染色體不同時分離的現象，例如其中一個子細胞的染色體已經分離進入后期Ⅱ或末期Ⅱ，而另一個子細胞的染色體還處在細胞的中央，未進行分離（圖3-C、D、E）。在后期Ⅱ觀察到提前分離的染色體和落后染色體（圖3-F、G），但是每個子細胞中落后染色體的數目均較少，后期Ⅱ異常細胞的比例約占73.5%。

2.1.6 末期Ⅱ～四分體 減數分裂的末期Ⅱ，到達兩級的染色體已經解螺旋，子細胞中間形成細胞板，新的核膜和核仁形成，形成四分體（圖1-J），此時觀察到三分體、微核、大小不均等的四分體以及多面體等異?，F象（圖3-I、J、K、L），其中大小不均等的四分體出現的頻率較高，約為46.7%，三分體、微核及多面體均較少，頻率未統計。本研究中F1代花粉母細胞減數分裂指數大約為53.3%，表明其具有較大的遺傳不穩定性。

2.2 花粉母細胞減數分裂不同步性觀察結果

取雜交F1代同一小花的3個花藥于同一玻片上進行制片觀察其花粉母細胞減數分裂情況，結果有多個分裂時期同時存在于一張制片中，如終變期、中期Ⅰ、后期Ⅰ和中期Ⅱ等，最大跨度為6個分裂時期（圖4），說明雜交F1代花粉母細胞減數分裂存在較大的不同步性。

2.3 DAPI染色觀察結果

采用DAPI熒光染料對雜交F1代早期花粉粒細胞進行染色觀察，以鑒定花粉敗育的時期。結果發現大多數小孢子在單核時期就發生皺縮變形（圖5-A），說明甘蔗屬熱帶種與蔗茅屬滇蔗茅遠緣雜交F1代花粉敗育的時期為單核小孢子時期及之前的小孢子母細胞時期和四分體時期。

2.4 成熟花粉粒育性觀察結果

取父本滇蔗茅（對照）及雜交F1代材料的成熟花粉粒，用1% I2-KI溶液進行染色觀察，結果父本滇蔗茅（云南95-19）的花粉量多，花粉粒呈圓形，顏色呈黑色或黑褐色，可育率達90.9%（圖6-A）。而所觀察的8個雜交F1代植株的花粉量均很少，花粉粒形狀不規則、發生皺縮變形，染色效果為淡黃色或基本不染色，花粉無活力，花粉敗育率為100%（圖6-B）。

3 討論與結論

減數分裂過程同源染色體是否能夠順利重組對二價體的正確形成和同源染色體的精確分離至關重要。因為重組形成的交叉是同源染色體分別受兩極紡錘絲牽引穩定排列在赤道板上所必需的[27]。安洪周等[28]的研究結果表明，光稃野燕麥遺傳物質干擾了小麥同源染色體或部分同源染色體的正常配對，造成F3代株系減數分裂異常和遺傳不穩定。

在小麥遠緣雜交后代減數分裂過程中經常形成后期落后染色體，落后染色體滯留在細胞質進一步形成微核，微核中染色體大多為外源染色體[29-30]。這些外源染色體在雜種胚的發育過程中會逐代消除[31]，其所攜帶外源有益基因隨之消失。小孢子母細胞減數分裂過程是否正常是花粉可育性的關鍵，劉春等[32]和吳杉等[33]的研究結果表明：減數分裂過程中染色體橋、不等二價體、滯后染色體、微核等異?，F象都會造成百合育性低。在作物遠緣雜交中，由于F1染色體組來源不同，染色體組間存在不平衡性，減數分裂染色體配對異常，常出現單價體，落后染色體以及微核等現象，因此導致了雜種不育[34]。胡丹艷[35]對（亞洲棉×比克氏棉）F1雙二倍體不育系小孢子減數分裂過程進行觀察時發現在中期Ⅰ染色體散落在赤道板外、后期Ⅰ多價體的不等分配、配對二價體整體分離、中期Ⅱ染色體不同步分離、落后的染色體丟失或隨機分配、異常紡綞體產生多極分離，形成多分孢子，產生微核。這些孢子中染色體數目相差頗大，最終形成畸形、小花粉粒，導致不育。栽培稻與非AA組野生稻雜種不育性的研究結果表明，雜種花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ以單價體為主，無法配對，由此導致雜種幾乎完全雄性不育[36-38]。傅雪琳等[39]對廣陸矮4號與高稈野生稻種間雜種的花粉育性與胚囊育性及其發育過程做了系統研究，表明栽培稻與非AA組野生稻種間雜種是一個集合了異源染色體的新個體，這必將使不同染色體組來源的染色體在雜種F1減數分裂過程中行為異常，從而產生染色體不育所導致的胚囊敗育和花粉敗育。目前主要通過以加倍的栽培稻同源四倍體與非AA組野生稻雜交[40]，或對栽野雜種F1染色體加倍，提高雜種雌配子育性，再與栽培稻親本回交[41]等方法來提高雜種育性。

本研究結果與前人的研究結果較相似，在甘蔗熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代花粉母細胞減數分裂過程中，觀察到落后染色體、中期Ⅱ染色體不同步分離以及異常四分體等異?，F象，充分說明了滇蔗茅染色體導入后影響了甘蔗同源染色體以及部分同源染色體的重組和分離，減數分裂過程產生異常染色體行為和異常細胞分裂是導致雜交F1代植株花粉完全敗育的主要原因。本研究為甘蔗屬熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代花粉敗育機制的研究提供了細胞學依據，同時為今后如何更有效地利用滇蔗茅及其雜交后代材料等提供細胞學參考資料。本文采用常規染色體壓片法進行顯微觀察，無法區分甘蔗屬熱帶種染色體和滇蔗茅染色體，所以對于落后染色體的來源，以及滇蔗茅染色體是否與甘蔗屬熱帶種染色體發生交換重組，還需要進一步借助基因組熒光原位雜交技術進行分析鑒定。

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