短短芽胞桿菌FJAT—0809—GLX幾丁質酶基因chiD的克隆與原核表達

黃丹丹等

摘 要 以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到幾丁質酶基因chiD序列，再將chiD序列連接到pMD18-T克隆載體上，形成重組載體pMD18-T-chiD，轉化大腸桿菌DH5ɑ并測序，經過核苷酸和氨基酸序列分析獲得幾丁質酶基因chiD的序列片段為1 524 bp，編碼507個氨基酸，理論蛋白質分子量約54.55 ku，其等電點約為5.77，表明該幾丁質酶為酸性幾丁質酶。將重組質粒pMD18-T-chiD雙酶切后與表達載體pET-28a連接，構建重組表達載體pET28a-chiD，并轉入大腸桿菌BL21中進行IPTG誘導表達，結果表明：重組蛋白質的分子量約55 ku，與預測的蛋白分子量結果一致。為了提高重組蛋白的表達量，對培養時間、IPTG濃度和溫度3個參數進行優化，并將表達產物進行SDS-PAGE分析，最后得出重組載體pET28a-chiD的最佳誘導表達參數分別為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。這為短短芽胞桿菌來源的幾丁質酶的進一步研究奠定了良好基礎。

關鍵詞 短短芽胞桿菌；幾丁質酶基因；克隆；表達；IPTG誘導

中圖分類號 R378 文獻標識碼 A

Abstract The chromosome DNA from Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX was treated as a template to obtain chiD chitinase gene by PCR amplification. The recombinant plasmid pMD18-T-chiD was constructed by lingking gene chiD sequence and plasmid pMD18-T. Nucleotides and amino acids sequence of chitinase gene was analyzed and the results showed that gene chiD was 1 524 bp encoding a 54.55 ku protein of 507 amino acids with pI 5.77. The chitinase gene from the recombinant plasmid was linked with the expression vector pET-28a digested with the same two restriction enzymes， and the recombination expression vector pET28a-chiD was conctructed. And the expression vector was transformed into E.coli BL21（DE3） successfully. In order to improve protein expression index， the recombinant expression vector was induced to express and the expression product was detected by SDS-PAGE electrophoresis. The results indicated that the expressed protein molecular weight was about 55 ku， which was consistent with the prediction result. The vector pET28a-chiD was induced to express with different cultural time， isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside（IPTG） concentrations and temperature， and the results showed that the best inducing parameters were 8 hours， 0.5 mmol/L and 28 ℃. It would lay a good foundation for the further research of chiD chitinase from B. brevis FJAT-0809-GLX.

Key words Brevibacillus brevis；Chitinase gene；Clone；Express；IPTG induction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.017

幾丁質是由N-乙酰-D氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的線性高分子聚合物[1]，廣泛存在于甲殼類生物、昆蟲的外殼及真菌的細胞壁中[2]。幾丁質酶是一種能夠降解幾丁質的內切酶，具有一系列復雜的結構[3]，主要由糖苷水解酶18家族和19家族的成員組成，其中大多數植物和放線菌產生的幾丁質酶屬于19家族，而真菌產生的幾丁質酶屬于18家族[4]。其作用機制為：首先由內切幾丁質酶將幾丁質水解成為由N，N-二乙酰殼二糖苷組成的小分子低聚糖，再由外切β-N-氨基葡萄糖苷酶將這些低聚糖降解為β-1，4-N-乙酰-D-葡萄糖胺[5]。幾丁質酶能夠分解昆蟲圍食膜和細胞壁中的幾丁質，破壞昆蟲和病原真菌的防御系統，提高植物的自我防御能力，抑制病原菌的生長，促進農業生產和環境保護。

國內外已有許多文獻報道，將微生物幾丁質酶基因成功的在工程菌中克隆和重組表達。Driss等[6]將幾丁質酶成功應用于Bacillus thuringiensis細胞外毒素的重組表達以增強其抗蟲活性。Hu等[7]將蘇云金芽胞桿菌中的幾丁質酶基因和毒蛋白基因整合在一起進行組成型表達，以增加毒蛋白對農業害蟲的毒害作用。王焰玲等[8]研究環狀芽胞桿菌C-2中的幾丁質酶基因序列在枯草芽胞桿菌中表達，分析其序列同源性，并作了重組枯草芽胞桿菌對稻瘟病菌的抑菌試驗，其抑菌效果相對于無幾丁質酶活性的枯草芽胞桿菌提高了46.38%。黃玉杰等[9]也將枯草芽胞桿菌中的幾丁質酶基因轉入伯克氏菌中，構建含有重組表達載體pRChi113的工程菌，檢測到其對大麗花輪枝孢、立枯絲核菌、麥根腐長蠕孢、和谷絲核菌的抑制效果明顯提高。本研究結合相關文獻，預將本實驗室保存的一株具有抑菌活性的革蘭氏陽性菌[10]短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX中的幾丁質酶基因進行克隆，并在大腸桿菌中表達，結合基因和氨基酸序列預測分析，以獲得一個新的幾丁質酶基因序列和其一級結構信息，為短短芽胞桿菌來源的幾丁質酶的進一步研究奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX、大腸桿菌DH5α由本實驗室菌種庫保存，大腸桿菌BL21（DE3）為福建省農業科學院植物保護研究所陳慶河研究員饋贈；載體pMD18-T購于Takara生物科技有限公司，pET-28a由福建省農業科學院土壤與肥料研究所賈憲波饋贈。

1.1.2 酶與試劑 限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自Takara生物有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自BioTeke公司，dNTPs購自北京天根生物有限公司，3 000 bp marker購自ferments生物有限公司，Mini Plasmid extraction kit購自OMEGA生物有限公司；X-Gal 和IPTG使用終濃度分別為2%和20%，氨芐青霉素和卡那霉素終濃度均為50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 引物與PCR擴增 以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX全基因組測序得到的幾丁質酶開放閱讀框為模板，設計特異性引物，引物兩端分別添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，特異性擴增幾丁質酶基因chiD，引物序列為：chiD01 F′：5′-CGCGGATC

CATGTATTTTTTGATGAGAAAAGC-3′和chiD02R′：5′-CCGCTCGAGTGACTTAATGAATCAAGCGAACT-3′。以短短芽胞桿菌全基因組DNA（按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行提取操作）為模板進行特異性PCR擴增，其擴增條件為： 94 ℃，預變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸10 min，完成PCR的擴增程序。

1.2.2 幾丁質酶基因的克隆 利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴增得到的幾丁質酶基因序列產物，將其亞克隆到克隆載體pMD18-T上，16 ℃連接過夜后熱擊轉化入感受態細胞大腸桿菌DH5α中，用含有40 μL 2% X-Gal、7 μL 20% IPTG和50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板進行陽性克隆子的篩選，挑取白色克隆子作特異性PCR擴增驗證，并提取陽性克隆質粒送至上海博尚生物科技有限公司測序。

1.2.3 重組表達載體pET28a-chiD的構建 以重組克隆載體pMD18-T-chiD為模板，chiD01和chiD02為引物，PCR擴增幾丁質酶基因，擴增產物用PCR產物純化試劑盒純化后用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收，與同樣經過相同雙酶切處理的表達載體pET-28a連接，連接產物熱擊轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并利用含有終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板篩選轉化子，轉化子經特異性PCR和酶切電泳鑒定，最后獲得重組質粒pET28a-chiD，構建過程見圖1。

從重組大腸桿菌DH5α中提取重組質粒pET28a-chiD，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3），得到的陽性轉化子經特異性PCR和酶切電泳鑒定，最后獲得陽性表達轉化子。

1.2.4 幾丁質酶的誘導表達條件優化 將陽性轉化子轉接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，培養至OD值為0.8，加入不同濃度的IPTG，在不同誘導時間和溫度下誘導重組表達轉化子，并利用SDS-PAGE凝膠電泳分析確定最佳的誘導表達條件。其誘導條件見表1。

2 結果與分析

2.1 短短芽胞桿菌幾丁質酶基因chiD核苷酸序列分析

將幾丁質酶基因chiD序列提交到NCBI，獲得登錄號為KF894918。由表2可知，DNAman軟件分析得到幾丁質酶基因chiD的ORF序列片段長度為1 524 bp，G+C含量約占總量的49.7%，其雙鏈dsDNA分子量為939.51。在NCBI上進行序列比較分析，得出本實驗中短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX幾丁質酶核苷酸序列與短短芽胞桿菌NBRC 10059幾丁質酶基因chiD的核苷酸同源相似度分別為97%，且與蠟樣芽胞桿菌NC7401、橙色標樁菌DW4/3-1、粘細菌DSM 2259、蘇云金芽胞桿菌Al Hakam和炭疽芽胞桿菌A16的核苷酸均具有較高的同源性，結果見表2。

2.2 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX幾丁質酶的氨基酸序列分析

利用DNAman和ExPASy蛋白分析軟件中的ProtParam、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NetNglyc 1.0 server和SOPMA等工具對所獲基因推導的氨基酸序列進行在線分析，結果顯示，幾丁質酶基因編碼507個氨基酸，蛋白質的相對分子量約為54.55 ku，理論等電點約為5.77，屬于Ⅱ類幾丁質酶和糖苷水解酶18家族。從幾丁質酶基因編碼的氨基酸序列比較來看，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX與短短芽胞桿菌NBRC 10059、短芽胞桿菌BC25的同源性分別達到97%和93%，而與其他Ⅱ類幾丁質酶序列的同源性在50%～65%。

幾丁質酶基因編碼的氨基酸序列見圖2，在chiD的N端，首先為一段含有29個氨基酸的信號肽，該信號肽可被革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及其他原核生物識別，革蘭氏陰性菌的可識別斷裂位點為Met-30和Phe-32，革蘭氏陽性菌和其他原核生物的可識別位點為Met-30。其后第30～76氨基酸的間隔區域為酶底物結合區，也是糖苷水解酶5～12家族的保守區，其中芳香族氨基酸Tyr和Trp高度保守。第88～163個氨基酸間隔區域為一個纖連蛋白Ⅲ折疊區（Fibronectin， typeⅢ），之后第180～496氨基酸的間隔區域為該幾丁質酶的酶催化區域，其中第183～487氨基酸為糖苷水解酶18家族的催化保守區，第286～294氨基酸為預測的蛋白質活性位點，Glu-294為一個質子供體。N-糖基化位點分析結果顯示，氨基酸序列中存在8個天冬氨酸或天冬酰胺的N-糖基化位點，分別位于第91、143、158、193、231、259、309、491位氨基酸，在這些位點后皆存在跨膜螺旋Asn-Xaa-Ser/Thr序列。此外，蛋白質二級結構預測分析結果表明，該蛋白中存在ɑ-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲部分。

2.3 重組表達載體pET28a-chiD的構建

將經限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的幾丁質酶基因片段和同樣經雙酶切處理的表達載體pET-28a用T4連接酶進行連接，熱擊轉化大腸桿菌DH5α，并對獲得的重組表達載體pET28a-chiD作PCR和雙酶切驗證。由圖3可知，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，發現在約1 500 bp處顯示有清晰條帶，初步確定為陽性轉化子。進一步對陽性克隆中的重組質粒進行提純，用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 500 bp處出現清晰條帶（圖4），最終確定為陽性轉化子，將獲得的重組質粒送至博尚生物技術（上海）有限公司測序，結果顯示序列匹配率為100%，說明在重組表達載體的構建過程中，幾丁質酶基因已正確連接到表達載體pET-28a上，并未發生突變。

2.4 重組幾丁質酶的誘導表達驗證及其誘導條件優化

將重組表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，構建含幾丁質酶基因的工程菌。通過不同的IPTG濃度、時間和溫度誘導幾丁質酶基因表達，并采用SDS-PAGE電泳檢測酶的表達情況。由圖5可知，當IPTG濃度為0.5 mmol/L，28 ℃下誘導表達8 h時（泳道1），在約55 ku處出現清晰的目標蛋白質條帶（圖5中所示），而陰性對照組（只含表達載體pET-28a的大腸桿菌BL21）在相應位置未出現目標條帶，由此可確定重組表達載體pET28a-chiD表達成功。與此相反，其他誘導條件下的泳道中也出現目標條帶，但其條帶均較弱，蛋白濃度很低，由此表明最佳的誘導表達參數為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。另外，電泳檢測結果中發現在分子量18、38 ku附近出現微弱的條帶（見圖5中泳道3、7、8、10、11所示），推測可能是幾丁質酶的降解產物[11]。

3 討論與結論

原核生物的基因片段一般為啟動子序列、編碼區和終止子序列，其編碼區通常由分泌信號肽、酶催化區、粘連蛋白TypeⅢ同源區和底物結合區等4個基本功能區構成。許多細菌幾丁質酶的氨基酸序列一般表現為N端催化區域，C端底物結合區域，甚至一些細菌的幾丁質酶含有多個催化區域，如Howard等[12]研究發現microbulbifer degradans的幾丁質酶B含有2個催化域，其中N端催化域對幾丁二糖衍生物的降解速率為C端催化域的13.6倍，而C端催化域對幾丁三糖的降解速率為N端催化域的2.7倍，N端催化域和C端催化域分別表現為外切幾丁質酶和內切幾丁質酶的活性。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的幾丁質酶催化區在C端，底物結合區在N端，推斷該幾丁質酶表現內切幾丁質酶活性，對幾丁高聚糖產物的降解效果可能更好。同時，活性位點對蛋白酶的功能有著重要影響，糖苷水解酶18家族活性位點的共有基序為“DXDXE”[13-15]，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的幾丁質酶中含有DLDLE基序，可見第290～294氨基酸為其活性位點的保守殘基，該幾丁質酶具有較好的催化活性。另外，信號肽序列在不同的細菌中表達時其剪切位點會出現差異[16-17]，夏啟玉等[18]將一株香蕉內生細菌的幾丁質酶基因克隆入大腸桿菌，構建含信號肽和不含信號肽的幾丁質酶表達菌株，進一步檢測發現兩者在胞外均具有幾丁質降解活性，得出此幾丁質酶的信號肽能被BL21識別，將幾丁質酶分泌到培養基中。本研究中預測幾丁質酶基因chiD編碼的蛋白信號肽在短短芽胞桿菌中的識別位點為Met-30， 在大腸桿菌中識別位點變為Met-30和Phe-32，且在重組大腸桿菌胞外也檢測到幾丁質酶活性為5.09 U/mL（文中未描述），推斷大腸桿菌BL21可識別該幾丁質酶的信號肽，并將其分泌到胞外。

幾丁質酶基因chiD在載體pET-28a的T7啟動子調控下能夠誘導表達，且誘導條件不同，其重組工程菌的表達量不同。Ye等[19]將沙雷氏菌中的幾丁質酶基因與表達載體pET-28a重組，并在大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達，通過SDS-PAGE電泳檢測，得到其最佳誘導參數分別為4 h、0.5 mmol/L和25 ℃，幾丁質酶的表達量在此條件下更大。而本實驗中優化含有重組表達載體pET28a-chiD的大腸桿菌工程菌的表達條件，獲得的最佳誘導參數分別為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃，此條件下SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶更明顯，由此說明工程菌的生長時間和溫度會影響重組酶的誘導表達，IPTG的添加濃度也會對表達量產生影響。另外，本實驗重組表達的幾丁質酶預測等電點約為5.77，呈現酸性，與短芽胞桿菌屬其他亞種的堿性幾丁質酶[20-21]存在差異，這說明短芽胞桿菌屬細菌的幾丁質酶有著多樣性。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX具有較好的抑菌效果和果品保鮮作用[22-23]，其抑菌功能物質也有初步研究[23]，但對其幾丁質酶的研究甚少。同時，由于短芽胞桿菌屬細菌中幾丁質酶的研究大多停留在分離純化層面，關于其基因的分子克隆與重組表達的研究鮮見報道，因此本研究構建了短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX基因克隆和原核表達體系，為該幾丁質酶基因的活性功能位點的研究奠定基礎，為其它功能基因的研究提供平臺，后續工作將對重組表達幾丁質酶的相關酶學性質和功能調控機制做進一步的研究。

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