枇杷花藥胚狀體成苗條件的優(yōu)化

潘翠萍等

摘 要 以‘大五星枇杷花藥培養(yǎng)獲得的子葉胚為材料，研究基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、4 ℃低溫處理、飽和CaCl2脫水處理、“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理對(duì)胚狀體成苗的影響，并優(yōu)化枇杷花藥培養(yǎng)及植株再生技術(shù)體系。結(jié)果表明：枇杷花藥胚狀體經(jīng)“4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水”預(yù)處理7 d效果最佳；將預(yù)處理后的胚狀體種于萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS+3%蔗糖，胚狀體成苗率最高，為78.2%；將再生植株移栽入配比為腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1的基質(zhì)中時(shí)，組培苗移栽成活率達(dá)85.25%。

關(guān)鍵詞 枇杷；花藥培養(yǎng)；子葉胚；成苗

中圖分類(lèi)號(hào) S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The anther-derived cotyledon embryoid of loquat（Eriobotrya japonica Lindl. cv. ‘Dawuxing）was used as material to optimize the plant regeneration system. A series of experiments were carried out to investigate the effects of basic medium， sucrose concentrations， 4 ℃ low temperature pretreatment， saturated CaCl2 dehydration pretreatment and“4 ℃ low temperature + saturated CaCl2 dehydration”pretreatment on plantlet formation of microspore embryoid in Loquat. The results showed that after pretreatment in“4 ℃ low temperature+ saturated CaCl2 dehydration ” for 7 days， the plantlet formation rate was the highest. 78.2% of complete plantlets were succesfully obtained on 1/2 MS medium supplemented with 3.0% sucrose after the embryos were pretreated for 7 days in “4 ℃ cryogenic treatment and saturated CaCl2 dehydration”. The complete plantlets survived at a rate of 85.25% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers， garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）.

Key words Loquat；Anther culture；Cotyledon embryoid；Plantlet formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.019

枇杷童期長(zhǎng)，基因雜合度高，常規(guī)育種周期長(zhǎng)，可達(dá)10～20 a[1]。近年來(lái)日趨完善的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為枇杷的育種開(kāi)辟了一條新途徑[2]。枇杷遺傳轉(zhuǎn)化工作一直都受到關(guān)注，但是進(jìn)展相當(dāng)緩慢，外植體再生難度大且遺傳轉(zhuǎn)化方法及條件均未成熟[3]，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)枇杷轉(zhuǎn)基因植株成功的報(bào)道。

植物遺傳轉(zhuǎn)化的眾多研究已經(jīng)證明，胚狀體是理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)[4]。迄今為止，轉(zhuǎn)基因果樹(shù)多是通過(guò)胚狀體發(fā)生途徑獲得的[5]。有關(guān)枇杷花藥胚狀體方面的報(bào)道較少，李俊強(qiáng)[6]初步建立了枇杷花藥培養(yǎng)及植株再生技術(shù)體系，隨后，秦紅玫[7]和楊志武[8]對(duì)枇杷花藥胚胎的發(fā)生及發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察，并對(duì)枇杷花藥胚狀體的誘導(dǎo)及成苗條件進(jìn)行了篩選，但胚狀體成苗率低的問(wèn)題一直未能得到很好解決，限制了該項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

因此，本實(shí)驗(yàn)以‘大五星枇杷花藥培養(yǎng)獲得的子葉胚為材料，對(duì)影響枇杷花藥胚成苗的因素進(jìn)行了優(yōu)化，完善了枇杷花藥胚狀體再生技術(shù)體系，為利用基因工程手段進(jìn)行枇杷種質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘大五星枇杷花藥胚狀體保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室，保存培養(yǎng)基為MS+ ZT 0.05 mg/L+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.02 mg/L+瓊脂7.5 g/L+蔗糖30 g/L，選取子葉胚為試材（圖1-A）。

1.2 方法

1.2.1 胚狀體的萌發(fā)成苗 ①不同預(yù)處理方式對(duì)胚狀體萌發(fā)成苗的影響。選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的‘大五星枇杷花藥子葉胚，進(jìn)行萌發(fā)前預(yù)處理：（1）4 ℃低溫處理：設(shè)置7、14、21、28、35、42 d共6個(gè)時(shí)段（人工氣候箱調(diào)節(jié)），以不作處理為對(duì)照；（2）飽和CaCl2脫水處理：將子葉胚置于飽和CaCl2 環(huán)境條件下，設(shè)置5個(gè)時(shí)間段1、3、5、7、9 d，以不作處理為對(duì)照； （3）“飽和CaCl2脫水+4 ℃低溫”處理：將胚狀體置于飽和CaCl2環(huán)境條件下，同時(shí)進(jìn)行4 ℃低溫處理，處理時(shí)間設(shè)置為1、3、5、7、9、11 d，6個(gè)時(shí)段，以不作任何處理為對(duì)照。所有處理完成后將花藥胚轉(zhuǎn)入成熟、萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L中。每個(gè)處理接種50個(gè)胚狀體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體成苗率（萌發(fā)成完整植株的胚狀體數(shù)/接種的胚狀體數(shù)×100%）。

②基本培養(yǎng)基及蔗糖濃度對(duì)胚狀體萌發(fā)成苗的影響。選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的‘大五星枇杷花藥子葉胚，用篩選出的預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行預(yù)處理后接種于胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基上，胚狀體萌發(fā)基本培養(yǎng)設(shè)置為（MS、1/2MS）、添加不同濃度的蔗糖15、30、50 g。每個(gè)處理接種50個(gè)胚狀體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)胚狀體成苗率（萌發(fā)的胚狀體數(shù)/接種的胚狀體數(shù)×100%）和長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.2 再生植株的煉苗移栽 當(dāng)再生小植株根長(zhǎng)為3～5 cm時(shí)即可進(jìn)行煉苗移栽，方法是在培養(yǎng)室揭去封口膜培養(yǎng)3 d，然后取出試管苗洗去培養(yǎng)基，移栽到含有不同配比的基質(zhì)中，每種基質(zhì)移栽30株，重復(fù)3次，常規(guī)管理，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率（移栽成活的組培苗數(shù)/移栽組培苗數(shù)×100%）。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照時(shí)間14 h/d，光照強(qiáng)度為30 μmol/（m2·s）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚狀體的萌發(fā)成苗

2.1.1 不同預(yù)處理對(duì)胚狀體萌發(fā)的影響 胚狀體不進(jìn)行預(yù)處理，形成完整植株的百分率低（5.3%～6.0%），大部分胚狀體僅形成了根（42.5%～45.1%），而沒(méi)有芽的分化。少部分胚狀體僅形成了芽（7.5%～8.6%），而沒(méi)有根的分化。可見(jiàn)，胚狀體的發(fā)育有3種情況：僅形成根，而不分化出芽（圖1-B）；僅分化出芽，而不形成根（圖1-C）；既分化出根又分化出芽，形成完整植株（圖1-D～E）。

不同預(yù)處理方式對(duì)枇杷花藥胚狀體成苗率的影響有較大差異。3種預(yù)處理方式（4℃低溫處理、飽和CaCl2脫水處理、“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理）均能顯著提高胚狀體的成苗率，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3種處理方式胚狀體的成苗率均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)4℃低溫處理時(shí)間為28 d時(shí)，胚狀體成苗率為62.4%，顯著高于其它低溫各處理（表1）；飽和CaCl2脫水處理7 d時(shí)，胚狀體成苗率為50.4%，為脫水處理中最高（表2）；對(duì)枇杷胚狀體進(jìn)行“4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理7 d時(shí)，胚狀體成苗率高達(dá)76.6%，為所有處理中最高（表3）。綜上所述，“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理7 d，為枇杷胚狀體成苗最佳的預(yù)處理方式。

2.1.2 基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)胚狀體的萌發(fā)成苗的影響 基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)枇杷胚狀體成苗的影響見(jiàn)表4。當(dāng)基本培養(yǎng)基一定時(shí)，胚狀體成苗率隨著蔗糖濃度的升高（1.5%～5.0%），呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度為3.0%時(shí)，成苗率高，達(dá)72.5%（MS）和78.2%（1/2MS））； 當(dāng)蔗糖濃度為5.0%時(shí)， 成苗率較低，為47.5%（MS）和40.1%（1/2MS）；當(dāng)蔗糖濃度為1.5%時(shí)，成苗率居中， 為50.4%（MS）和55.3%（1/2MS）。為進(jìn)一步分析基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)胚狀體成苗率影響的差異性，對(duì)胚狀體成苗率進(jìn)行了F檢驗(yàn)，結(jié)果表明：蔗糖濃度對(duì)胚狀體成苗的影響達(dá)到了極顯著水平（F=510.77，p<0.01），而基本培養(yǎng)基對(duì)胚狀體成苗的影響則不顯著，F(xiàn)值為1.32。多重比較結(jié)果顯示，蔗糖濃度為3%時(shí)，胚狀體成苗率最高，極顯著高于其它處理。綜上所述，枇杷花藥胚狀體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+3%蔗糖。

2.2 再生植株的煉苗移栽

經(jīng)煉苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基質(zhì)里植株成活率和植株長(zhǎng)勢(shì)差異較大。從表5可看出，移栽基質(zhì)配比為腐葉土 ∶ 珍珠巖=3 ∶ 1時(shí)，組培苗移栽成活率為45.62%，植株葉片小，莖桿細(xì)，葉色泛黃，長(zhǎng)勢(shì)弱；移栽基質(zhì)配比為腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1時(shí)，組培苗移栽成活率達(dá)85.25%，植株葉片大，莖桿粗壯，葉色深綠，長(zhǎng)勢(shì)健壯（圖1-E）。由此可見(jiàn)，腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1為枇杷生根組培苗移栽的適宜基質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

植物花藥培養(yǎng)中胚狀體成苗率低甚至得不到再生植株的現(xiàn)象比較普遍[9]。許多物種存在胚狀體質(zhì)量差，成熟度不高，抗性低等問(wèn)題，最終造成了成苗率低[10]。因此，對(duì)胚狀體進(jìn)行萌發(fā)前預(yù)處理就顯得尤為重要。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，促進(jìn)胚狀體萌發(fā)的方法很多，如植物激素浸泡處理[11]，胚狀體形態(tài)篩選[12]，低溫處理[13]，脫水處理[14-15]，在培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或其它物質(zhì)[16]以及液體培養(yǎng)[17]等。李俊強(qiáng)等[6]報(bào)道枇杷花藥胚狀體較難成苗，正常情況下僅有5%的胚狀體能夠形成完整植株，秦紅枚[7]研究認(rèn)為枇杷花藥胚狀體經(jīng)一定時(shí)間脫水處理后其成苗率比對(duì)照提高了14.9%。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探討了低溫處理（4 ℃）、飽和CaCl2脫水處理以及‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理對(duì)胚狀體成苗的影響，結(jié)果表明：未經(jīng)處理的枇杷胚狀體形成完整植株的比率低，為5.3%～6%。對(duì)胚狀體進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理（4 ℃）、飽和CaCl2脫水處理以及‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理均能有效的提高胚狀體的成苗率，其中以‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理7 d效果最佳，其成苗率為76.6%。

研究表明，胚狀體成熟時(shí)，除了形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)育外，還需要積累一定的能源物質(zhì)（淀粉和多糖的積累），從而起到為新發(fā)育階段提供能量的作用[18]。通常認(rèn)為脫水處理能使胚狀體誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝停滯的狀態(tài)，從而使許多物種胚狀體能夠長(zhǎng)時(shí)間貯藏，同時(shí)，脫水過(guò)程中水分的丟失被認(rèn)為是建立對(duì)干旱耐受性的信號(hào)[15]。

Pond等[19]研究表明，低溫處理可以部分地替代脫水處理，在脫水時(shí)同時(shí)進(jìn)行低溫處理增強(qiáng)了體胚的抗逆性，從而促進(jìn)了胚的萌發(fā)。

本研究以‘大五星枇杷花藥子葉胚為材料，完善了‘大五星枇杷花藥培養(yǎng)及植株再生技術(shù)體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)體枇杷進(jìn)行遺傳改良奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 董燕妮， 鄧群仙， 王永清，等. 我國(guó)枇杷種質(zhì)資源與育種的研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2008， 4（2）： 92-96.

[2] 劉松瑜， 謝深喜， 陶愛(ài)群，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2009， 25（9）： 179-183.

[3] 崔文寧. 成年植株枇杷葉片再生體系建立的初步研究[D]. 雅安， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[4] 湯浩茹， 王永清. 核桃體細(xì)胞胚發(fā)生與轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2000， 36（3）： 102-110.

[5] 林順權(quán)， 宋 剛， 馬 英， 等. 果樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2001（28）： 589-596

[6] Li J Q， Wang Y Q， Lin L H， et al. Embryogenesis and plant regeneration from anther culture in loquat（Eriobotrya japonica L.）[J]. Scientia Horticulture， 2007， 115（4）： 329-336.

[7] 秦紅玫. 枇杷花藥胚胎發(fā)生發(fā)育、 再生植株的RAPD分析及EMS誘變研究[D]. 雅安， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[8]楊志武. 枇杷花藥胚狀體制備技術(shù)體系的優(yōu)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 雅安， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[9] 詹 艷， 陳勁楓. 黃瓜游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)成胚和植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2009， 36（2）： 221-226.

[10] Etienne H， Montoro P， Michaux-Ferriere N， et al. Effects of desiccation， medium osmolarity and abscisic acid on the maturation of Hevea brasiliensis somatic embryos[J]. Journal of Experiment Botany， 1993（44）： 1 613-1 619.

[11] Parrott W A， Dryden S G， Vog D F， et al. Optimization of somatic embryogenesis and embryo germination in soybean[J]. In Vitro Celluar & Developmental Biology Plant， 1988（24）：817-821.

[12] Buchheim J A， Colburn S M， Ranch J P， et al. Maturation of soybean somatic embryos and the transition to plantlet growth[J]. Plant Physiology， 1989（89）： 768-775.

[13] Wang Q C， Gafny R， Sahar N， et al. Cryopreservation of grapevine（Vitis vinifera L.）embryogenic cell suspensions by encapsulation-dehydration and subsequent plant regeneration[J]. Plant Science， 2002（162）： 551-558.

[14] Wang Y S， Tong Y， Li Y F， et al. High frequency plant regeneration from microspore-derived embryos of ornamental kale（Brassica oleracea L. var. acephala）[J]. Scientia Horticulturae，2011， 130（1）： 296-302.

[15] Black M F， Corbineau H， Gee C D， et al. Water content，raffinose， and dehydrins in the induction of desiccation tolerance in immature wheat embryos[J]. Plant Physiology，1999（120）： 463-471.

[16] Cheng Y， Ma R L， Jiao Y S， et al. Impact of genotype，plant growth regulators and activated charcoal on embryogenesis induction in microspore culture of pepper（Capsicum annuum L.）[J]. South African Journal of Botany， 2013（88）： 306-309.

[17] Supena E D J， Custers J B M. Refinement of shed-microspore culture protocol to increase normal embryos production in hot pepper（Capsicum annuum L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2011， 130（4）： 769-774.

[18] Konradova H， Grigova M， Lipavska H， et al. Cold-induced accumulation of raffinose family oligosaccharides in somatic embryos of Norway spruce（Picea abies）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2003， 39（4）： 425.

[19] Pond S E， Aderkas P V， Bonga J M， et al. Improving tolerance of somatic embryos of Picea glauca to Hash desiccation with a cold treatment（desiccation after cold acclimation）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2002（38）： 334-341.