木薯轉化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息學分析

吳曉慧等

摘 要 轉化酶抑制子調控轉化酶的活性，在植物的糖代謝過程中具有重要作用。為了研究木薯的轉化酶抑制子，本實驗利用木薯基因組數據庫分析及RT-PCR方法，從木薯中分離了1個木薯轉化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列長度為564 bp，包含 528 bp的完整開放閱讀框，編碼127個氨基酸，N端有16個氨基酸殘基的信號肽，4個保守的半胱氨酸殘基可形成兩個二硫橋。亞細胞定位預測表明，MeINH3蛋白定位于胞外。根據生物信息學分析結果，推測其可能抑制木薯細胞壁轉化酶活性。

關鍵詞 木薯；轉化酶抑制子；基因克隆；生物信息學分析

中圖分類號 S533；Q78 文獻標識碼 A

Abstract Invertase inhibitor controls the activity of invertase and plays a significant role in the sucrose metabolic processes in plants. An invertase inhibitor gene MeINH3 was isolated from cassava by cassava genome database analysis and RT-PCR. Analysis of the sequence indicated that the cDNA of MeINH3 was consisted of 564 bp with an open reading frame（ORF）of 528 bp encoding 127 amino acids. MeINH3 had a signal peptide including 16 amino acids at N terminus and four conserved cysteine residues forming two disulfide bridges. The subcellular localization prediction showed that MeINH3 protein was located extracellularly， suggesting that it may inhibit the activity of cassava cell wall invertase.

Key words Cassava； Invertase inhibitor； Gene cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.010

木薯（Manihot esculenta Crantz）是一種富含淀粉的塊根作物，原產南美洲亞馬遜河盆地，是熱帶亞熱帶地區重要的糧食與經濟作物之一[1]。木薯淀粉的合成及積累是由植物體內一系列相關酶催化下完成的[2]。研究木薯淀粉合成過程中蔗糖代謝相關酶的活性變化，對高淀粉木薯新品種的選育具有非常重要的意義。在木薯葉片光合作用形成的蔗糖，經過韌皮部運輸、卸載進入木薯塊根，轉化酶在這一生理過程中起著非常重要的作用[2-3]。轉化酶（Iinvertase）在植物體內催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖[4]，根據等電點、酶活的最適pH值、可溶性和亞細胞定位，可將轉化酶區分為三類：液泡轉化酶（Inv-V）、細胞壁轉化酶（Inv-CW）和中性/堿性轉化酶（Inv-N）[5]。轉化酶參與了植物的韌皮部卸載[6]、抵御病原菌侵染[7]、逆境脅迫反應[8]、器官的形態建成[9]等生理過程。轉化酶活性的調節包括轉錄調節和翻譯后調節[10]。轉化酶抑制子（invertase inhibitors，INH）與轉化酶特異結合，抑制轉化酶活性，屬于翻譯后調節[10]。轉化酶抑制子基因由多基因家族編碼，擬南芥基因組中有40多個與轉化酶抑制子基因同源的序列[11]。轉化酶抑制子調節木薯轉化酶的活性，間接調節了碳水化合物的分配，因此研究木薯轉化酶抑制子有助于闡明木薯淀粉積累機制。

1961年Schwimmer等[12]在研究馬鈴薯轉化酶的酶學特性時發現了INH的存在。1998年Greiner等[13]首次從煙草懸浮細胞中克隆獲得INH的基因序列，其重組蛋白可以抑制轉化酶活性。成善漢[14]在馬鈴薯塊莖中表達煙草液泡轉化酶抑制子基因Ntinhh抑制了馬鈴薯液泡轉化酶的活性，最終降低馬鈴薯還原糖的含量。這表明通過調節INH的表達，控制轉化酶的活性，導致植物體內蔗糖代謝的改變。目前已有兩個木薯轉化酶抑制子基因MeINH1和MeINH2被克隆[15]，本實驗克隆了木薯轉化酶抑制子基因MeINH3，并進行生物信息學分析，為進一步研究木薯轉化酶抑制子功能及其調控機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 以中國熱帶農業科學院培育的SC8木薯葉片為實驗材料，種植于海南大學農學院試驗基地，植后90 d采樣。

1.1.2 主要試劑 RNAplant plus Reagent植物總RNA提取試劑購自天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0和DL 2 000 DNA Marker購自TaKaRa公司，DNA片段回收試劑盒和卡那霉素購自上海生工生物工程技術服務有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；pEASY-T1 Cloning Kit 購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木薯葉片總RNA提取及反轉錄 采用RNAplant plus Reagent植物總RNA提取試劑提取SC8木薯葉片總RNA，具體操作參照產品說明書；總RNA經電泳檢測后，采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0進行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參照試劑盒提供的操作方案進行。

1.2.2 木薯轉化酶抑制子基因的PCR擴增及序列分析 根據美國木薯基因組數據庫（http：//www.phytozome.net/cassava）預測到一個木薯轉化酶抑制子基因，設計特異引物擴增MeINH3基因。

上游引物：5′-GCAGCTAGTGGTCATGGGAAA

GG-3′

下游引物：5′-GCTAACTCGAAATTGGGTATGT

GAAA-3′

以SC8木薯葉片的cDNA為模板，擴增MeINH3基因，反應體系為：TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）5 μL，dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，加水補足至50 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA片段回收試劑盒回收目的片段，連接pEASY-T1載體，轉化DH5α感受態細胞，并涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB固體培養基，37 ℃過夜培養。挑取菌斑到含卡那霉素（100 μg/mL）的1.5 mL液體LB培養基，37 ℃振蕩培養（200 r/min）8 h，菌液PCR鑒定陽性克隆送上海英俊生物技術有限公司測序。采用DNAMAN 6.0軟件進行序列分析及同源樹構建；采用在線軟件對木薯轉化酶進行亞細胞定位預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及信號肽分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。

1.2.3 MeINH3的蛋白質3D結構預測 利 用 Swiss-Model服務器（http：//swissmodel.expasy.org）對木薯轉化酶抑制子MeINH3蛋白質3D結構的進行同源建模。模板為煙草細胞壁轉化酶（PDB： 2cj8）。采用Pymol 軟件顯示和分析木薯轉化酶抑制子MeINH3的3D結構。

2 結果與分析

2.1 木薯葉片總RNA提取及MeINH3的RT-PCR擴增

木薯葉片總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰完整，沒有降解，質量較好，可用于后續的基因克隆實驗（圖1）。以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，利用基因特異引物進行PCR擴增獲得1條大小約600 bp的片段（圖2）。

2.2 MeINH3的生物信息學分析

RT-PCR擴增片段測序結果表明，以特異引物擴增獲得了一段564 bp的cDNA序列，其中包含一段528 bp的開放閱讀框，編碼127個氨基酸殘基的蛋白質，推斷的分子質量為18.91 ku。MeINH3編碼的氨基酸序列與本實驗室已克隆的兩個轉化酶抑制子（MeINH1和MeINH2）的氨基酸序列比對發現，它們氨基酸相似性在36%～61%之間，并且都具有4個保守的半胱氨酸殘基位點，第一個殘基和第二個殘基可形成一個二硫橋，第三個殘基和第四個殘基形成另一個二硫橋，這兩個二硫橋的存在，對MeINH的功能形成是必要的（圖3）。利用在線軟件Swiss-Model serve（http：//swissmodel.expasy.org）進行MeINH3的蛋白質3D結構預測。結果表明，MeINH3由5個β螺旋（N端兩個β螺旋較小，C端β螺旋較大）和無規則卷曲構成，4個半胱氨酸殘基可形成兩個二硫橋（Cys31與Cys40，Cys99與Cys140）（圖4）。

3個木薯轉化酶抑制子在N端都含有一段信號肽，MeINH1和MeINH2的信號肽分裂位點位于VQS和DAN之間，MeINH3的信號肽長度為16個氨基酸殘基，分裂位點位于VHA和AIP之間（圖3、5）。亞細胞定位預測表明，MeINH3定位于細胞外，預測得分為0.772（表1）。

木薯（Manihot esculenta Crantz）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、咖啡（Coffea canephora）、煙草（Nicotiana tabacum）、香瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）和野草莓（Fragaria vesca）轉化酶抑制子的氨基酸序列比對及蛋白的系統樹分析結果表明，不同的基因編碼的INH同源性較低（圖6），相似性在12.7%～61%之間。MeINH1和MeINH2在一個進化分支上，與擬南芥的AtCVIF1親緣關系最近，氨基酸序列相似性分別為40.1%和42.6%；MeINH3在另一進化分支，與玉米的ZmINH親緣關系最近，氨基酸序列相似性為17.14%。

3 討論與結論

本實驗克隆獲得的MeINH3的蛋白質分子質量為18.91 ku，這一結果與植物INH蛋白分子質量（16～20 ku）相符[16]。有研究結果表明，植物INH蛋白的4個保守半胱氨酸殘基可分別形成兩個二硫橋，使蛋白結構穩定并具有活性[10]。本實驗室獲得的3個木薯INH基因編碼的蛋白質中都具有4個保守的半胱氨酸殘基。MeINH3的蛋白質3D結構建模預測分析發現，Cys31與Cys40，Cys99與Cys140可分別形成兩個二硫橋。這表明，二硫橋對MeINH3的蛋白結構的穩定具有重要作用。植物INH蛋白的N端均具有一段信號肽序列，以利于蛋白質的運輸[10]。木薯的3個INH蛋白（MeINH1-3）的N端同樣具有一段信號肽序列，其中MeINH3的信號肽最短（16個氨基酸殘基），分裂位點位于VHA和AIP之間。系統樹分析結果表明，MeINH3與MeINH1、MeINH2的親緣關系較遠，與玉米的ZmINH親緣關系最近。亞細胞定位預測結果表明，MeINH3定位于細胞外。根據以上生物信息學分析結構，可推測MeINH3可調控細胞壁轉化酶的活性。

INH是多基因編碼的蛋白，家族成員的序列保守性較差[17]，對3個木薯INH氨基酸序列比對及與其他物種的進化樹分析也證明了家族成員的序列保守性較差（氨基酸相似性在36%～61%之間）。INH與果膠甲酯酶抑制子PMEI的序列較為相似，INH或PMEIs同源的基因都稱為果膠甲酯酶相關蛋白序列（PMEI-RPs）[12]。只通過序列分析還無法區分INH和PMEI[10]，所以克隆獲得的3個序列（MeINH1-3）還需要進一步實驗，表達重組蛋白驗證MeINH1-3是否真正抑制木薯轉化酶活性。本研究對木薯轉化酶抑制子基因MeINH3進行了克隆及行生物信息學分析，為進一步研究木薯轉化酶抑制子功能及其調控機制奠定了基礎。

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