‘紅陽’獼猴桃中花青素轉錄調控因子AdGL3的克隆及表達分析

李文彬等

摘 要 為闡明轉錄因子在獼猴桃果肉花青素形成過程中的調控作用，采用3′RACE和5′RACE技術從‘紅陽獼猴桃果肉中克隆到一個bHLH型轉錄調控因子AdGL3。實時熒光定量PCR結果表明，AdGL3基因的表達水平與獼猴桃花青素的凈積累過程基本一致，即在凈積累過程中表達水平比較高，而凈積累停止后，該基因的表達水平也相應降低。表明該基因是參與獼猴桃花青素合成的重要調控因子之一。結果為下一步獼猴桃花青素形成機制及調控機理的研究奠定基礎。

關鍵詞 獼猴桃；花青素；AdGL3基因；表達水平

中圖分類號 S663.4 文獻標識碼 A

Abstract To investigate the regulation mechanism of transcript factor on anthocyanin biosynthesis in red-fleshed A. Chinensis cv. Hongyang， AdGL3 was cloned from flesh according to the conserved domains through 5′ and 3′ RACE method. The results of quantitative real time PCR indicated that the relative expression level of AdGL3 was consistent with the net accumulation change of anthocyanin that it had high transcript level when the net accumulation of anthocyanin happened and low after the net increase stopped， suggesting that AdGL3 should be one of important transcript factors for anthocyanin biosynthesis. It could be benefit to illustrate the mechanism of anthocyanin biosynthesis and regulation in kiwifruit.

Key words A. Chinensis cv. Hongyang； Anthocyanin； AdGL3； Expression level

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.014

獼猴桃隸屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），為多年生木質藤本植物，雌雄異株。中國獼猴桃自然資源異常豐富，獼猴桃屬物種間和種內存在著高度的遺傳變異，尤其是果肉的顏色豐富多彩，有綠色、黃色、紅色、橙色、紫色、綠底紅心或黃底紅心。近年來，中國加快了紅肉獼猴桃品種的選育和改良，在國際市場上，富含花青素的特質是紅肉獼猴桃倍受消費者青睞的關鍵特性，未來將占據更大的市場份額。但是，目前市場上唯一的紅肉品種‘紅陽獼猴桃品種不抗夏季高溫干旱，果肉中花青素的含量易受夏季溫度和濕度波動的影響[1]。而花青素的含量高低直接影響到‘紅陽獼猴桃的經濟價值和種植戶的經濟利益，因此，獼猴桃中花青素合成調控機理對‘紅陽獼猴桃花青素積累量的研究非常重要。

目前對植物花青素合成途徑的研究已經非常清楚[2-4]，花青素生物合成途徑受多種轉錄因子在不同時空上的組合調控，主要包括MYB、bHLH、亮氨酸拉鏈、MADS-box、WD40、WIP和WRKY等因子[5]，大部分物種的花青素合成是由MYB、bHLH、WD40這三類轉錄因子形成的轉錄復合物MBW來調控[6-7]。近年來，已經從擬南芥[8]、葡萄[9]、大麗菊（Dahlia variabilis）[10]、蘋果[11]等植物中克隆了bHLH類轉錄調控因子基因，并且證明其對花青素合成有正調控作用。bHLH（basic helix-loop-helix， 堿性螺旋-環-螺旋）類轉錄因子是植物中僅次于MYB的第二大轉錄因子家族，bHLH類轉錄因子一方面通過與WD40結合進而對形成調控花青素的復合物MBW非常重要[12]，而且在R2R3-MYB蛋白的穩定性和轉錄調控作用中發揮重要作用。另一方面bHLH蛋白可以通過提高花青素結構基因中啟動子區的活性，進而增加轉錄因子與結構基因作用的穩定性[13]。如葡萄中調節花青素合成的bHLH基因VvMYC1和VvMYCA1，VvMYC1能與葡萄所有R2R3-MYB蛋白（VvMYB5a/5b、VvMYBA1/A2、VvMYBPA1）相互作用，激活花青素或者原花青素合成結構基因如查耳酮異構酶（CHI）、花青素還原酶（ANR）、類黃酮糖基轉移酶（UFGT）的表達[14]。本研究從‘紅陽獼猴桃果肉中克隆到一個bHLH類轉錄調控因子AdGL3基因，對其序列及在‘紅陽獼猴桃果實發育過程中的表達水平進行研究，為獼猴桃花青素合成機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為2012年四川蒲江種植的‘紅陽獼猴桃（四川中興農業科技有限公司提供）。分別于坐果后30、60、70、90、100、110、120、140 d采集‘紅陽獼猴桃果肉。

每個生育期取3個果實取樣后用冰浴保溫箱帶回實驗室，取出果肉中果皮部分（即花青素積累部位），在液氮中速凍，-70 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 ‘紅陽獼猴桃果肉花青素的提取及測定

冰凍的果肉在液氮中研磨至粉沫，然后用五倍體積的甲醇/水/乙酸（體積比80 ∶ 20 ∶ 1）提取[15]，以錫箔紙包裹，28 ℃、200 r/min，提取30 min，于4 ℃冰箱中放置24 h，以0.45 μm的濾紙過濾，上層清液50 ℃旋轉蒸發濃縮。

高效液相色譜檢測花青素含量，以美國Water公司的Alliance2695液相色譜儀進行測定，C18柱（Nova-pak），規格為150 mm×3.9 mm，顆粒度4 μm。流動相A為1%的甲酸，B相為乙腈，流速0.8 mL/min，530 nm下檢測。

花青素標準品為cyaniding 3-O-galactoside （Chromadex USA， CAS No. 27661-36-5）和cyaniding 3-O-glucoside（WAKO，Jap，CAS No. 7084-24-4）。

1.2.2 ‘紅陽獼猴桃RNA的提取及檢測 采用改良的CTAB法提取RNA[16]。

RNA提取后，以1%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的RNA進行完整性檢測，以Nanodrop2000分光光度計來檢測RNA濃度及A260 nm/A280 nm值。

1.2.3 AdGL3基因的克隆、驗證及序列分析 根據已報道的擬南芥中bHLH基因保守區設計引物，引物序列為：

5′引物為：5′-TGGGGNGAYGGNTAYTAYAA-3′

3′引物為：5′-AYTCNGTRTCNGCNARRTCYTC-3′

3′RACE和5′RACE參照大連寶生物公司3′ （Takara Code： D314）和5′（Takara Code：D315）RACE試劑盒說明書進行?；騊CR產物純化回收后連接pEASY載體（北京全式金生物技術有限公司）測序。

進化樹分析軟件采用MEGA（V 5.02）進行。

1.2.4 AdGL3基因在果實發育過程中的表達水平分析 將3個果實分別提取RNA后，等量混合形成RNA池，再反轉錄成cDNA，根據AdGL3基因的cDNA序列設計特異性引物進行實時熒光定量PCR試驗（RT-PCR），序列特異性引物如下：

5′引物：5′-AAAAGGTTATTGTTGGGGTAATGG

CA-3′

3′引物：5′-ACCGTCTTCCTCGTCTTAATGTCT

C-3′

獼猴桃Actin（GI：149938963）基因為內參基因，其序列特異性引物如下：

5′引物：5′- TGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAG

T-3′

3′引物：5′-TTCCTTACTCATGCGGTCTGCGAT-3′

實時熒光定量PCR條件：

1.5 μg總RNA以FastQuant RT kit（with gDNase）（TIANGEN Biotech）（北京）進行反轉錄合成第一鏈cDNA。1 μL cDNA模板，10 μL SYBRR Premix ExTaqTM（DRR041A，Takara），0.2 μmol/L正反向引物，RT-PCR在Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR（Applied Biosystem， Foster City， CA， USA）儀上進行，每個基因3個重復，以基因AdActin（GI：149938963）在30DAA處的值作為標準。

擴增程序為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環； 72 ℃ 20 s，溶解曲線程序為95 ℃ 15 s；95 ℃ 1 min內以0.3 ℃遞增，最后95 ℃ 15 s。

2 結果與分析

2.1 ‘紅陽獼猴桃果實發育期間花青素變化趨勢

‘紅陽獼猴桃果實花青素的結果顯示，果實中花青素的積累經歷了緩慢-快速-下降-再升高的過程（圖1）。開花后到花后30 d，果實中沒有花青素的積累，花后30～60 d為緩慢積累期，中果皮部位逐漸出現紅色絲狀分布的花青素，表明花青素開始積累，這段時期花青素的積累較慢。而花后70～90 d為花青素快速積累期，直到花后100 d，花青素凈積累持續增加，此時果肉中花青素的濃度達到最高（56.9 μg/g 鮮重）。此后，花青素的含量不穩定凈積累量下降（120 d），而在收獲前又略有上升（140 d）。

2.2 RNA質量及濃度檢測

以1%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的RNA進行完整性檢測（圖2），發現提取的總RNA均呈現2條清晰、無明顯拖尾現象的條帶，說明獲得的總RNA樣品完整性較好。其中RNA濃度都比較高，且OD值要求達到：1.8≤A260 nm/A280 nm≤2.2，A260 nm/A230 nm≥1.8，RNA濃度范圍為540～1 500 ng/μL。高質量高純度的RNA為下一步cDNA反轉錄、基因克隆及實時熒光定量PCR提供保證。

2.3 基因克隆及序列分析

AdGL3基因cDNA全長約2 027 bp（圖3）。對其序列進行分析后，結果發現AdGL3基因開放閱讀框為1 947 bp，編碼一個由649個氨基酸組成的蛋白，利用NCBI在線工具保守區序列分析（Conserved Domain Search Service）軟件對其編碼的氨基酸序列結構進行分析，證明其具有保守結構域bHLH-MYB_N和HLH（圖4）。

利用MEGA（5.0）軟件，將AdGL3基因編碼的氨基酸序列與已報導的模式植物擬南芥、葡萄等的同源基因的氨基酸序列進行比對，發現與葡萄（Vitis vinifera）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AdGL3進化關系最近，氨基酸序列相似性最高（圖5），表明AdGL3基因在功能上與已經報道的GL3基因對花青素的調控作用相關。

2.4 AdGL3基因在‘紅陽果實發育期間的表達模式

實時熒光定量PCR結果表明，果實發育期AdGL3的表達水平經歷了較明顯的高峰和平緩期，花后60 ～100 d，AdGL3的表達量變化幅度比較大，其中90 d時表達量是70 d時表達量的28倍，這可能與這一階段中花青素變化速率最大相關（圖6）。總體來說，AdGL3的表達水平與花青素凈積累的規律基本一致，花后30 d果實花青素開始合成，一直到100 d花青素呈現凈合成持續增加，而AdGL3的表達水平也呈現出持續增加趨勢，而當花青素在100 d后凈積累停止后，AdGL3基因的表達水平也呈現緩慢下降趨勢，直到果實成熟。

3 討論與結論

GLABRA3是擬南芥中最主要的調控毛狀體及根毛發育的復合蛋白之一[17]。近年來許多研究表明，GL3通過與MYB及WD40蛋白形成調控復合物MBW來調控花青素合成[6，18-19]。Myb/bHLH/WD40調控復合物主要調控花青素合成途徑中的后期合成基因，如二氫黃酮還原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和類黃酮糖苷轉移酶（UFGT）等[20]。本研究克隆得到的AdGL3基因具有與其他物種中調控花青素的bHLH類基因GL3相似的結構，很可能是參與‘紅陽獼猴桃中花青素合成的重要轉錄調控因子之一。

在本研究中，AdGL3基因在‘紅陽獼猴桃果肉中花青素凈積累增加的過程中保持較高的表達水平，尤其在花青素快速合成期（70～90 d），其表達水平的變化幅度最大。一般來說轉錄因子的轉錄表達總是先于受調控基因的表達，從而對被調控基因進行調控，花青素的合成將更加滯后于受調控基因的表達[21]，這可能是AdGL3基因的表達水平與花青素凈積累增加的趨勢不太一致的主要原因。果實中花青素的合成是一個復雜的調控過程，積累水平受到內部遺傳、生長發育和外部環境的影響[6]，基因的轉錄水平也會受到影響。

花青素含量是果實品質的一個重要方面，因此也是許多遺傳育種工作的重點，通過轉錄因子來調控果實的品質，如花色和果色，是目前一種非常有效的方法。獼猴桃是重要的經濟水果之一，尤其是紅肉獼猴桃—‘紅陽以其果實富含花青素而成為近年來消費者的新寵。本研究中獲得的AdGL3基因對‘紅陽獼猴桃花青青合成機制研究有重要作用。

參考文獻

[1] 黃宏文. 獼猴桃屬分類資源馴化栽培[M]. 北京： 科學出版社， 2013： 246.

[2] Hichri I， Barrieu F， Bogs J， et al. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway[J]. J Exp Bot， 2011， 62（8）： 2 465-2 483.

[3] Koes R E， Quattrocchio F， Mol J N M. The flavonoid biosynthetic pathway in plants： Function and evolution[J]. BioEssays， 1994， 16： 123-132.

[4] Schijlen E G， Ric De Vos C H， Van Tunen A J， et al. Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants[J]. Phytochemistry， 2004， 65（19）： 2 631-2 648.

[5] Marles M A， Ray H， Gruber M Y. New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and molecular regulation[J]. Phytochemistry， 2003， 64（2）： 367-383.

[6] Gonzalez A， Zhao M， Leavitt J M， et al. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the ttg1/bhlh/myb transcriptional complex in arabidopsis seedlings[J]. Plant J， 2008， 53（5）： 814-827.

[7] Lin-Wang K， Micheletti D， Palmer J， et al. High temperature reduces apple furit colour via modulation of the anthocyanin regulatory complex[J]. Plant， Cell & Environment， 2011， 34（7）： 1 176-1 190.

[8] Cominelli E， Gusmaroli G， Allegra D， et al. Expression analysis of anthocyanin regulatory genes in response to different light qualities in Arabidopsis thaliana[J]. J Plant Physiol， 2008， 165（8）： 886-894.

[9] Matus J T， Poupin M J， Canon P， et al. Isolation of wdr and bhlh genes related to flavonoid synthesis in grapevine（Vitis vinifera L.）[J]. Plant Mol Biol， 2010， 72（6）： 607-620.

[10] Ohno S， Hosokawa M， Hoshino A， et al. A bhlh transcription factor， dvivs， is involved in regulation of anthocyanin synthesis in dahlia（Dahlia variabilis）[J]. J Exp Bot， 2011， 62（14）： 5 105-5 116.

[11] Xie X B， Li S， Zhang R F， et al. The bhlh transcription factor mdbhlh3 promotes anthocyanin accumulation and fruit colouration in response to low temperature in apples[J]. Plant Cell Environ， 2012， 35（11）： 1 884-1 897.

[12] An X H， Tian Y， Chen K Q， et al. The apple wd40 protein mdttg1 interacts with bhlh but not myb proteins to regulate anthocyanin accumulation[J]. J Plant Physiol， 2012， 169（7）： 710-717.

[13] Grotewold E. The genetics and biochemistry of floral pigments[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57： 761-780.

[14] Hichri I， Heppel S C， Pillet J， et al. The basic helix-loop-helix transcription factor myc1 is involved in the regulation of the flavonoid biosynthesis pathway in grapevine[J]. Mol Plant， 2010， 3（3）： 509-523.

[15] Montefiori M， Mcghie T K， Costa G， et al. Pigments in the fruit of red-fleshed kiwifruit（Actinidia chinensis and Actinidia deliciosa）[J]. J Agric Food Chem， 2005， 53（24）： 9 526-9 530.

[16] 阮孟斌， 李文彬， 于曉玲， 等. 高質量RNA快速提取方法[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（9）： 1 704-1 707.

[17] Ramsay N A， Glover B J. Myb-bhlh-wd40 protein complex and the evolution of cellular diversity[J]. Trends Plant Sci， 2005， 10（2）： 63-70.

[18] Feyissa D N， Lovdal T， Olsen K M， et al. The endogenous gl3， but not egl3， gene is necessary for anthocyanin accumulation as induced by nitrogen depletion in arabidopsis rosette stage leaves[J]. Planta， 2009， 230（4）： 747-754.

[19] Nukumizu Y， Wada T， Tominaga-Wada R. Tomato（Solanum lycopersicum）homologs of triptychon（sltry）and glabra3（slgl3）are involved in anthocyanin accumulation[J]. Plant Signal Behav， 2013， 8（7）： 10-14.

[20] Zhang F， Gonzalez A， Zhao M， et al. A network of redundant bhlh proteins functions in all ttg1-dependent pathways of arabidopsis[J]. Development， 2003， 130： 4 859-4 869.

[21] Spelt T C， Quattrocchio F， Mol J N， et al. Anthocyanin1 of petunia encodes a basic helix-loop-helix protein that directly activates transcription of structural anthocyanin genes[J]. Plant Cell， 2000， 12（9）： 1 619-1 632.