海南普通野生稻OrNAC5的克隆和表達分析

徐靖等

摘 要 根據EST序列信息，從海南普通野生稻中克隆了一個NAC（NAM， ATAF and CUC）類轉錄因子OrNAC5。該基因編碼區cDNA長度699 bp，編碼232個氨基酸，對應的DNA長度為2 538 bp，含有3個外顯子和2個內含子。推導的OrNAC5氨基酸序列具有典型的NAC類轉錄因子結構特征，與水稻（Oryza sativa）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha）、大麥（Hordeum vulgare）、谷子（Setaria italica）中相應蛋白的同源性分別為99%、81%、60%和58%。對OrNAC5啟動子序列進行分析，結果發現存在多種激素應答和脅迫響應的調控元件。Real-Time PCR結果顯示，低溫、干旱和鹽脅迫均能誘導OrNAC5的表達。上述結果表明OrNAC5可能在逆境響應過程中具有重要功能。

關鍵詞 普通野生稻；OrNAC5；逆境；基因表達

中圖分類號 S511.9 文獻標識碼 A

Abstract Bast on EST sequences， a gene named OrNAC5 conding NAC（NAM， ATAF and CUC）transcription factor was cloned from wild rice（Oryza rufipogon）in Hainan. The cDNA length was 699 bp and DNA length was 2 538 bp， containing three exons and two introns. The deduced OrNAC5 had the typical structure of NAC transcription factor， and showed high identities of 99%， 81%， 60% and 58% to those of NAC transcription factors from Oryza sativa， Oryza brachyantha， Hordeum vulgare and Setaria italica. Elements related to stress signals and hormone were found in putative promoter region of OrNAC5. Real-Time PCR results showed that OrNAC5 was induced by drought， salt stress and low temperature stress. All these data suggest that OrNAC5 may play important roles in regulating stress response.

Key words Oryza rufipogon； OrNAC5； Stress； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.016

干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫嚴重影響了農作物的生長發育和作物產量[1-2]。植物已在分子、細胞和系統水平上進化出了一套復雜的信號網絡來感受并響應各種外界刺激，轉錄因子在這一過程中扮演重要的調控作用[3]。NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，含有一個大約150個氨基酸組成的高度保守的NAC結構域，廣泛參與植物的生長發育、激素調節和脅迫響應[3-4]。NAC轉錄因子在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、小麥（Triticum aestivum）等[4-7]植物中廣泛存在且數量眾多，擬南芥含有110個成員，水稻中則多達140個，但植物中只有少部分NAC轉錄因子的功能得到鑒定。最近，越來越多的研究證實NAC轉錄因子在響應干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫過程中具有重要功能[8-10]。

普通野生稻（Oryza rufipogon）是栽培稻的祖先，能夠長期生長在各種惡劣的自然條件下，具有很強的抗逆特性，是水稻抗逆育種重要的遺傳資源[11]。海南普通野生稻最原始，遺傳多樣性最高，具有很高的開發利用價值[12-13]。在先前的研究中，篩選獲得一批抗逆性較強的海南普通野生稻材料，能夠長期在干旱、低溫和貧瘠等條件下健康生長。為了進一步了解海南普通野生稻的抗旱機理，筆者對干旱條件下差異表達基因進行了分析，并篩選獲得了1條與水稻中NAC轉錄因子基因ONAC005（GenBank登錄號AK104766）同源性有99%的基因片段。本文在此基礎上對該基因進行克隆和表達分析，為揭示該基因在脅迫響應中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

將在海南省農業科學院野生稻異位保存圃中收集的普通野生稻（Oryza rufipogon）種子，置于50 ℃烘箱中干燥48 h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10 min，清水沖洗4～5次。置于28 ℃人工氣候箱培養（8 h光照/16 h黑暗），使用國際水稻所營養液[14]進行培養，每5 d換1次培養液，長至3葉期時于含有20% PEG的營養液中進行模擬干旱處理，含有150 mmol/L NaCl的營養液中進行鹽脅迫處理，4 ℃光照培養箱中（8 h光照/16 h黑暗）低溫處理，分別在處理0、2、4、6、12、24、48 h取樣，用液氮磨成干粉狀，-70 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及cDNA合成 普通野生稻葉片總RNA和基因組DNA的提取分別采用成都福際生物技術有限公司的植物總RNA提取試劑盒（RE-05011）和植物DNA提取試劑盒（DE-06111）進行，具體參見說明書。cDNA第一條鏈合成采用北京全式金生物技術有限公司反轉錄試劑盒（AT301-02），具體步驟參見說明書。

1.2.2 OrNAC5基因和啟動子的克隆 根據先前篩選獲得的NAC轉錄因子基因片段，在NCBI數據庫中搜索到與它最相似基因的cDNA序列，設計特異引物OsNAC1F：5′-TTGATACGATGGAGAGGG

CGGC-3′和OsNAC1R：5′-GATCGGTTTAATTAGTC

TGTT-3′。根據OrNAC5在水稻基因組中最相似基因的啟動子序列設計特異性引物PNAC1F：5′-CAG

ACAGATTGGCGAACCGGA-3′和PNAC1R：5′-GAA

GTACTTGTCCCCGTCGCT-3′，分別以海南普通野生稻cDNA和基因組DNA為模板，對OrNAC5的cDNA序列和啟動子序列進行擴增。PCR擴增反應：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經回收和純化后，與pMD-18T Cloning Kit（TAKARA公司）連接。將連接產物轉至DH5a感受態細胞，通過PCR檢測確定陽性克隆，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 OrNAC5生物學信息學分析 用ORF finder分析OrNAC5 cDNA序列的開放閱讀框，蛋白質序列分析在http：//www.expasy.org網站相關軟件完成；利用在線軟件GSDS對基因的外顯子/內含子進行界定；通過BLAST（網址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與GenBank中登記的序列進行同源性比較，用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行比對，并構建系統發育樹；利用啟動子順式作用元件預測網站PLACE軟件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan. html）對OrNAC5啟動子序列進行分析。

1.2.4 OrNAC5的表達分析 采用康為世紀公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及Mx3005P PCR儀進行PCR產物實時熒光檢測基因表達水平。目的基因引物為QNAC1F：5′-GGGTCATGCACGAGT

ACAG-3′和QNAC1R：5′-GCTGCTGCTCCTCTGAA

ATA-3′；內參引物為18S，其引物為18SF：5′-CG

TCCCTGCCCTTTGTACAC-3′和18SR：5′-CGAACA

CTTCACCGGATCATT-3′。PCR程序：95 ℃預變性 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。按默認程序繪制55 ℃至95 ℃融解曲線，并把 0 h的樣品設為Calibrator，進行相對表達定量分析。

2 結果與分析

2.1 OrNAC5基因克隆和分子特征

先前的研究中，在海南普通野生稻中獲得一條編碼NAC轉錄因子的EST序列，本研究在此基礎上對其編碼區cDNA序列和基因組序列進行了克隆，將獲得的基因命名為OrNAC5（GenBank登錄號KJ690249）。OrNAC5編碼區cDNA長度為699 bp，對應的DNA長度為2 538 bp，編碼232個氨基酸。編碼蛋白的分子量為24.70 ku，理論等電點為9.87。利用在線軟件GSDS，對OrNAC5的基因cDNA和DNA序列進行比較分析發現，OrNAC5的基因組包含3個外顯子和2個內含子（圖1），外顯子和內含子的剪接均符合GT-AG原則。

生物信息學分析結果表明，OrNAC5具有典型的植物NAC類轉錄因子結構特征，包含一個由138個氨基酸組成的NAC保守結構域（圖2）。OrNAC5與水稻ONAC005（BAG96939）同源性為99%，涉及3個氨基酸的變異；與短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_006659635）、大麥（Hordeum vulgare，CBZ41165）、谷子（Setaria italica XP_004974022）中相應蛋白的同源性分別為81%、60%和58%。

2.2 OrNAC5啟動子的克隆和序列分析

通過PCR擴增和序列比對，獲得OrNAC5翻譯起始密碼子ATG上游1 341 bp的啟動子序列，該序列和ONAC005相對應啟動子區的同源性為97%（圖3）。對OrNAC5啟動子序列進行預測分析，發現該序列具有真核生物典型啟動子結構特征，含有多個真核生物啟動子基本元件，如啟動子核心元件 TATA-box，增強子元件CAAT-box和GATA-box等；核心啟動子區位于ATG上游-227～ -184 bp，其可能的轉錄起始位點位于翻譯起始位點上游-193 bp處；OrNAC5啟動子區還含有眾多應答激素和脅迫信號元件，如茉莉酸應答元件CGTCA-motif、生長素應答元件TGA-element、赤霉素應答元件P-box和GARE-motif、厭氧應答元件ARE、高溫應答元件HSE、干旱應答元件MBS以及防御和脅迫響應元件TC-rich repeats等；此外，還含有與分裂組織表達相關元件CAT-box、胚乳表達相關元件Skn-1_motif和幼苗特異表達元件as-2-box 等。這說明OrNAC5可能廣泛參與生長發育、激素應答和脅迫響應等過程。

2.3 OrNAC5的表達分析

熒光定量PCR結果顯示，PEG模擬干旱、鹽和低溫處理均能顯著上調OrNAC5的表達。PEG處理后，OrNAC5的表達量在24 h 達到最大值（圖4-A）；OrNAC5的表達在鹽處理后早期變化并不明顯，直到48 h后顯著增加達到最大值（圖4-B）；OrNAC5對低溫比較敏感，處理后2 h OrNAC5的表達量顯著上調，6 h時達到最大值，48 h時仍維持較高水平（圖4-C）。

3 討論與結論

大量研究證實NAC轉錄因子在植物響應生物和非生物脅迫過程中發揮重要作用[8-10]。例如，在擬南芥中AtNAC019、AtNAC055和AtNAC072能夠激活下游鹽和干旱脅迫基因的表達來增強植株抗旱性[15]；AtNAC2參與多種激素和鹽脅迫響應，并與側根的發育有關[16]；ATAF1和ATAF2在干旱和病菌響應過程中具有重要作用[17]。在棉花中6個NAC轉錄因子基因被克隆鑒定，它們的表達受到干旱、高鹽、冷害等多種非生物脅迫的誘導。在水稻中也有多個NAC轉錄因子功能得到鑒定，通過表達OsNAC1、OsNAC5、OsNAC6、OsNAC045、OsNAC052和OsNAC063基因后能夠增強植株對干旱和多種非生物脅迫的耐受性[18-24]。雖然大量的NAC基因在不同植物中得到克隆，但只有小部分基因的功能得到鑒定。

海南普通野生稻能夠長期在干旱、低溫和貧瘠等條件下健康生長，具有較強的抗逆性。本研究在海南普通野生稻中篩選獲得一個受干旱誘導表達的NAC轉錄因子OrNAC5，該基因編碼的蛋白有232個氨基酸組成，初步確定該基因是一個多逆境應答基因。OrNAC5除了受到干旱的誘導外，也能對低溫和鹽脅迫做出響應。植物基因啟動子含有多種重要的順式作用元件，在轉錄水平上通過與轉錄因子的協調作用，參與調控下游基因的表達，從而使植物能夠對各種生物和非生物脅迫做出響應[25]。OrNAC5啟動子區含有厭氧應答元件ARE、高溫應答元件HSE、干旱應答元件MBS以及防御和脅迫響應元件TC-rich repeats等生物和非生物脅迫元件。進一步說明OrNAC5在野生稻的逆境脅迫響應中扮演重要角色。

普通野生稻馴化成栽培稻的過程中，一些基因會發生變異甚至丟失，這可能是普通野生稻具有更強的抗逆性的原因。OrNAC5在栽培稻中的同源基因ONAC005是一個功能未知基因，OrNAC5和ONAC005的編碼蛋白有3個氨基酸的差異，更大的差異在于啟動子區域，所以有必要對OrNAC5的功能進行繼續研究，下一步將構建該基因的植物表達載體，通過轉化水稻和擬南芥植物對其功能做進一步驗證。

參考文獻

[1] Ahuja I， de Vos R C H， Bones A M， et al. Plant molecular stress responses face climate change[J]. Trends in Plant Sci， 2010， 15（12）： 664-674.

[2] Liu G Z， Li X L， Jin G X， et al. Overexpression of rice NAC gene SNAC1 improves drought and salt tolerance by enhancing root development and reducing transpiration rate in transgenic cotton[J]. PLoS ONE， 2014， 9（1）： e86895.

[3] Qu L J， Zhu Y C. Transcription factor families in Arabidopsis： major progress and outstanding issues for future research[J]. Curr Opin Plant Biol， 2006， 9（5）： 544-549.

[4] Ooka H， Satoh K， Doi K， et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Res， 2003， 10（6）： 239-247.

[5] Fang Y， You J， Xie K， et al. Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice[J]. Mol Genet Genomics， 2008， 280（6）： 547-563.

[6] Le D T， Nishiyama R， Watanabe Y， et al. Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress[J]. DNA Res， 2011， 18（4）： 263-276.

[7] Mao X G， Zhang H Y， Qian X Y， et al. TaNAC2， a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in Arabidopsis[J]. J Exp Bot， 2012， 63（8）： 2 933-2 946.

[8] Nakashima K， Takasaki H， Mizoi J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochim Biophys Acta， 2012， 1819（2）： 97-103.

[9] Tran L， Nishiyama R， Yamaguchi-Shinozaki K， et al. Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach[J]. GM Crops， 2010， 1（1）： 32-39.

[10] Puranik S， Sahu P P， Srivastava P S， et al. NAC proteins： regulation and role in stress tolerance[J]. Trends Plant Sci， 2012， 17（6）： 369-381.

[11] 楊慶文， 黃 娟. 中國普通野生稻遺傳多樣性研究進展[J]. 作物學報， 2013， 39（4）： 580-588.

[12] 王效寧， 韓東飛， 云 勇， 等. 利用SSR標記分析海南普通野生稻的遺傳多樣性[J]. 植物遺傳資源學報， 2007， 8（2）： 184-188.

[13] 孫希平， 揚慶文， 李潤植， 等. 海南三種野生稻遺傳多樣性比較研究[J]. 作物學報， 2007， 33（7）： 1 100-1 107.

[14] 毛達如. 植物營養研究法[M]. 北京： 中國農業大學出版社， 2001.

[15] Tran L S， Nakashima K， Sakuma Y， et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter[J]. Plant Cell， 2004， 16（9）： 2 481-2 498.

[16] He X， Mu R， Cao W， et al. AtNAC2， a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways， is involved in salt stress response and lateral root development[J]. Plant J， 2005， 44（6）： 903-916.

[17] Delessert C， Kazan K， Wilson I W， et al. The transcription factor ATAF2 represses the expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis[J]. Plant J， 2005， 43（5）： 745-757.

[18] Meng C， Cai C， Zhang T， et al. Characterization of six novel NAC genes and their responses to abiotic stresses in Gossypium hirsutum L[J]. Plant Sci， 2009， 176（3）： 352-359.

[19] Hu H， You J， Fang Y， et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol， 2008， 67（1-2）： 169-181.

[20] Nakashima K， Tran L S， Van Nguyen D， et al. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice[J]. Plant J， 2007， 51（4）： 617-630.

[21] Yokotani N， Ichikawa T， Kondou Y， et al. Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis[J]. Planta， 2009， 229（5）：1 065-1 075.

[22] Takasaki H， Maruyama K， Kidokoro S， et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress inducible genes and stress tolerance in rice[J]. Mol Genet Genomics， 2010， 284（3）： 173-183.

[23] Hu H， Dai M， Yao J， et al. Overexpressing a NAM， ATAF， and CUC（NAC）transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103（35）： 12 987-12 992.

[24] Gao F， Xiong A， Peng R， et al. OsNAC52， a rice NAC transcription factor， potentially responds to ABA and confers drought tolerance in transgenic plants[J]. Plant Cell Tiss Org， 2009， 100（3）： 255-262.

[25] 聶麗娜， 夏蘭琴， 徐兆師， 等. 植物基因啟動子的克隆及其功能研究進展[J]. 植物遺傳資源學報， 2008， 9（3）： 385-389.