中國橡膠樹苗圃2種炭疽病菌分子鑒定及分布分析

摘 要 根據膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特異引物對，對采自中國云南、海南、廣東和廣西植膠區的138株炭疽病菌進行分子鑒定。結果顯示：138株炭疽菌中鑒定為膠孢炭疽菌的有100株，占總測定株數的72.46%，尖孢炭疽菌的有38株，占總測定株數的27.54%。其中海南、云南和廣東橡膠苗圃中膠孢炭疽菌占所分析菌株總數比例分別為81.82%（54/66）、60.0%（15/25）和77.27%（17/22），而廣西3個橡膠苗圃中的2個苗圃地尖孢炭疽和膠孢炭疽病菌各占一半。總體來看，國內橡膠樹苗圃地炭疽病病原菌仍以膠孢炭疽菌為主，部分苗圃同時存在膠孢和尖孢炭疽菌的危害。

關鍵詞 橡膠樹；膠孢炭疽；尖孢炭疽；種特異性PCR；分子鑒定

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract Based on the previous study， the Colletotrichum gloeosporioides-specific primers CgInt/ITS4， and the Colletotrichum acutatum-specific primers CaInt2/ITS4 and CAF53/CAR356 were used for taxon-speific amplification to characterize the Colletotrichum species of 138 isolates from Colletotrichum leaf disease lesions on Hevea brasiliensis on the rubber nurseries in China. The results revealed that only 38 isolates belonged to C. acutatum， and 100 isolates to C. gloeosporioides. The rates of C. gloeosporioides on the nurseries in Hainan， Yunnan， Guangdong and Guangxi provinces were 81.82%， 60.0%， 77.27% and 52%， respectively. On the whole， the results indicated that C. gloeosporioides was the dominant species responsible for Colletotrichum leaf disease on H. brasiliensis plants in China.

Key words Hevea brasiliensis； Colletotrichum gloeosporioides； Colletotrichum acutatum； Species-specific PCR； Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.024

炭疽菌（Colletotrichum spp.）是一類重要的植物病原真菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，其寄主范圍十分廣泛，包括蔬菜、牧草、果樹、花卉等數十種重要經濟作物。炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病是橡膠樹的一種重要葉部病害，可危害苗圃小苗、大田幼樹直至成齡開割膠樹，侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實等部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實腐爛，甚至形成僵果掛在樹上[1-2]。嚴重時會引起膠樹的重復落葉和嫩梢回枯，推遲開割時間[3]。該病于1905年在斯里蘭卡錫蘭首次發現[4]。橡膠樹炭疽病病原菌有膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Collectotrichum acutatum）2種。在植膠國中，多數認為膠孢炭疽菌為主要病原菌，如巴西、馬來西亞、印度、印度尼西亞和泰國；部分國家報道是以尖孢炭疽菌為主要病原菌，如斯里蘭卡[5]。

在我國，橡膠樹炭疽病于1962年在海南國營大豐農場首次發現。目前該病在我國普遍發生[6]，早期研究結果表明，在我國該病致病菌為膠孢炭疽菌[3，7]，2008年發現有尖孢炭疽菌為害[8]。研究結果表明，兩種炭疽菌在生物學特性、抗藥性和菌落形態上均存在較大差異[9-11]。但國內植膠區炭疽病菌以哪個種為主，至今未見報道。筆者于2013年調查了我國橡膠樹主要苗圃炭疽病的發生情況，并采集樣品進行室內分離鑒定。本研究以所分離的138株炭疽菌為研究對象，依據膠孢和尖孢炭疽菌特異引物對，利用PCR方法，對炭疽病菌的種類和分布進行分析，為該病防治策略的制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的138株炭疽菌為2013年筆者所在實驗室從國內橡膠主栽區收集的病樣中按照組織分離法進行分離獲得，并用柯赫氏法則進行了致病性鑒定。各菌株及癥狀描述詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態觀察 將各菌株分別接種于PDA平板上，置于28 ℃光照培養箱中培養。5～7 d觀察記錄菌落顏色、氣生菌絲濃密或稀疏等情況。

1.2.2 分子鑒定

（1）菌絲收集和基因組DNA提取。炭疽菌培養參考林春花等[17]的方法。采用高通量樣品組織研磨儀（TissuelyserⅡ，QIAGENR）小量提取待測菌株的基因組DNA，用蓋玻片將平板上的菌絲刮下放入樣品管中，每個樣品管放入2顆研磨珠，加入800 μL CTAB提取液，將樣品管放在適配器上（每個適配器最多可放96個樣品），再將適配器擰緊到研磨儀活塞上，設置破碎時間5 min，2～3次。破碎完成后取出溶液，采用常規方法，用氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）抽提兩次，取上清，用無水乙醇沉淀基因組DNA。

（2）特異引物及PCR檢測。根據文獻報道，膠孢炭疽菌鑒定引物對為CgInt/ITS4（CgInt：5′-GGCC

TCCCGCCTCCGGGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCT

TATTGATATGC-3′）[13-14]，能擴增獲得1條約450 bp的特異片段；尖孢炭疽菌鑒定引物對為CaInt2/ITS4（CaInt2：5′-GGGGAAGCCTCTCGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和CAF53/CAR356（CAF53：5′-GGGCAGGGGAAGCCTCTCG-3′、CAR356：5′-AGCGGTGCTTGAGGGTTG-3′），能分別擴增獲得1條約490 bp和303 bp的特異片段[15]。

PCR反應體系：10×Buffer 2.5 μL， 10 μmol/L 引物一0.5 μL，10 μmol/L 引物二0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，模板DNA 0.5 ng，0.5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O至總體積25 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃ 5 min，10 ℃ 保存，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，觀察記錄結果。

2 結果與分析

2.1 菌株形態觀察

本研究對2013年分離自我國橡膠主產區苗圃的138株炭疽菌（海南66株、云南25株、廣西25株和廣東22株）進行菌落形態觀察。結果詳見表1。

2.2 分子鑒定

利用特異性引物對CgInt/ITS4、CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356分別對138株炭疽菌進行PCR擴增。將引物對CgInt/ITS4能擴增獲得特異片段，而引物對CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356擴增不出特異性片段的菌株鑒定為膠孢炭疽菌；反之則鑒定為尖孢炭疽菌（圖1和表1）。根據鑒定結果，138株炭疽菌中鑒定為膠孢炭疽菌的有100株，占總測定株數的72.46%；尖孢炭疽菌的有38株，占總測定株數的27.54%。據此可以推測，國內主要橡膠樹苗圃中以膠孢炭疽菌為優勢種。

海南38個苗圃地中采集到的66株炭疽菌中，膠孢炭疽菌占81.82%（54/66），尖孢炭疽菌占18.18%（12/66）；其中的34個（占89.47%）苗圃發現有膠孢炭疽菌為害，11個（占28.75%）苗圃有尖孢炭疽菌危害，且樂東大安、白沙邦溪民營膠園、儋州兩院五隊、屯昌中建農場、瓊海東紅農場苗圃2、瓊海東紅農場苗圃3、萬寧東興農場、陵水什玲鎮什也村8個橡膠苗圃同時存在尖孢和膠孢炭疽菌的危害。

云南16個苗圃中，膠孢炭疽菌占64.0%（16/25），尖孢炭疽菌占36.0%（9/25）。其中的11個（占68.75%）苗圃發現有膠孢炭疽菌危害，8個苗圃（占50.00%）有尖孢炭疽菌危害，3個苗圃地同時存在尖孢和膠孢炭疽菌的為害。說明云南橡膠苗圃與海南橡膠苗圃一樣，以膠孢炭疽菌為優勢種，但其尖孢炭疽菌為害比例要比海南的高。

廣東5個苗圃中，膠孢炭疽菌占77.27%（17/22），尖孢炭疽菌占22.73%（5/22）。除了“廣東農墾亞熱帶作物研究所”樣品僅檢測到膠孢炭疽菌外，其他4個苗圃地既檢測到膠孢炭疽菌，也檢測到尖孢炭疽菌。其中，在“湛江市南亞所2”苗圃地的一片病葉上既分離到膠孢炭疽菌也分離到尖孢炭疽菌。

根據病樣癥狀類型差異，本研究在廣西東興農場3個苗圃地采集分離獲得25株炭疽菌，其中膠孢炭疽菌占52%（13/25），尖孢炭疽菌占48%（12/25）；東興農場2苗圃中分離到5個炭疽菌，其中膠孢炭疽有3株，尖孢炭疽為2株；另外兩個苗圃地炭疽菌的膠孢炭疽和尖孢炭疽數量相同，各占50%。說明在廣西東興農場的橡膠苗圃中，炭疽菌的種群結構由尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌按均等比例構成。

3 討論與結論

炭疽病是普遍存在的植物病害，引起炭疽病的病原菌為炭疽菌屬真菌，炭疽菌屬下的種很多，2009年Hyde等在研究和整理文獻的基礎上，列出了66個合格的分類單元，還指出存在爭議的19個種[16]。傳統的炭疽屬分類，是以形態學以及寄主范圍分類為主。種的分類主要以分生孢子形態、附著胞形態、剛毛的有無、分生孢子梗和產孢細胞的形態大小，菌核、厚垣孢子的有無及形態等作為分類依據[17]。但由于炭疽菌種間形態特征差異微小和不穩定，該屬中種的分類不統一。相對于形態學分類，分子分類能夠反映物種間核苷酸序列最本質的差異，分類性狀穩定而標準[18]。近年來，基于分子標記的系統學方法被廣泛應用于該屬真菌的分類。目前，已確定引起橡膠樹炭疽病的病原菌有兩種，分別為膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。據報道，通過孢子形態、有性態有無、生長速率和菌落顏色可區分尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌[19-21]。但是對于無長期分類經驗的學者來說，采用形態學方法對二者進行區分，在實踐過程中常常無法準確鑒定。本研究根據前人工作基礎，利用特異性引物對二者進行鑒定，方法準確、快速。

炭疽病是我國植膠區普遍發生的一種葉部病害。炭疽病菌存在較為豐富的遺傳變異，且隨著主栽品種的改變以及氣候條件的變化，橡膠樹炭疽病病原菌種群可能發生改變。本研究對我國海南、廣東、廣西和云南部分植膠區橡膠樹炭疽病菌的種進行鑒定，每個苗圃采集多個樣品，且對癥狀表現不同的樣品均進行分離鑒定，其結果基本反應了我國橡膠樹炭疽菌病原菌種類和分布的基本情況。云南省是我國橡膠種植主要種植地，本研究所收集的病樣只覆蓋云南省部分地區，其結果可能不能完全代表云南省橡膠樹炭疽病病原菌分布情況，但也基本說明了所調查地的情況。廣西橡膠種植地主要集中在東興市，本研究對其3個苗圃地詳細分析了炭疽病菌的種，顯示主要病原菌為膠孢和尖孢炭疽菌兩種。在海南、廣東和云南省也顯示部分苗圃地以尖孢炭疽菌為主。膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的抗藥性不同[11]，所使用的防治藥劑有所區別，本研究結果可為生產上科學合理用藥提供參考依據。

參考文獻

[1] 吳 寶， 陳權輝. 3%多菌靈煙劑（2號）防治橡膠炭疽病實驗小結[J]. 熱帶作物科技， 1994（6）： 42-43.

[2] Guyot J， Omanda E N， Ndoutoume A. et al. Effect of controlling Colletotrichum leaf fall of rubber tree on epidemic development and rubber production[J]. Crop Protection， 2001， 20（7）： 581-590.

[3] 劉秀娟， 楊業銅， 冷懷瓊. 我國植膠墾區橡膠樹炭疽病菌的種型鑒定[J]. 熱帶作物學報， 1987， 8（1）： 93-101.

[4] Petch T. Description of new Ceylon fungi[J]. Annual Report of Botanical Gardens， Peradeniya 1906， 3（1）： 1-10.

[5] Jayasinghe C K. Fernando THPS. and Priyanka UMS， Colletotrichum acutatum is the main cause of Colletotrichum leaf disease of rubber in Sri Lanka[J]. Mycopathologia， 1997， 137（1）： 53-56.

[6] Feng S F， Guo G， Zheng F C， General situation of anthracnose of rubber trees and its researches in China[A]. Proceedings of IRRDB Symposium， 1999： 288-297.

[7] 崔昌華， 鄭肖蘭， 劉洪平， 等. 橡膠樹炭疽病菌rDNA-ITS區序列分析[J]. 熱帶作物學報， 2006： 27（4）： 41-45.

[8] 張春霞， 何明霞， 李加智， 等. 云南西雙版納地區橡膠炭疽病病原鑒定[J]. 植物保護， 2008， 34（1）： 103-106.

[9] Jayashinghe C K， Fernando T H P S. Growth at different temperatures and on fungicide amended media： two characteristics to distinguish Colletotrichum species pathogenic to rubber[J]. Mycopathologia， 1998， 143（2）： 93-95.

[10] 張春霞， 李加智， 何明霞， 等. 兩種橡膠炭疽病菌生物學特性的比較[J]. 西南農業學報， 2008， 21（3）： 667-670.

[11] 蔡志英， 李加智， 王進強， 等. 橡膠膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對殺菌劑的敏感性測定[J]. 云南農業大學學報， 2008， 23（6）： 787-789.

[12] 林春花， 李超萍， 李博勛， 等. 橡膠樹炭疽病菌Cap20基因的克隆和序列分析[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（11）： 1 991-1 995.

[13] Brown A E， Sreenivasaprasad S， Timmer L W. Molecular characterization of slow-growing orange and key lime anthracnose strains of Colletotrichum from citrus as C. acutatum[J]. Phytopathology， 1996， 86（5）： 523-527.

[14] Freeman S， Minz D， Maymon M， et al. Genetic diversity within Colletotrichum acutatum sensu Simmonds[J]. Phytoopathology， 2001， 91（6）： 586-592.

[15] 劉先寶， 林春花， 蔡吉苗， 等. 橡膠樹尖孢炭疽菌分子檢測及遺傳多態性分析[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（2）： 273-277.

[16] Hyde K D， Cai L， Cannon P F， et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， 39（1）： 147-182.

[17] 劉曉云， 景 耀， 楊俊秀. 植物炭疽菌研究文獻綜述[J]. 西北林學院學報， 1995， 10（4）： 105-111.

[18] 張志光， 蔣盛巖. 真菌的分子生物學鑒定方法研究進展[J]. 生物學通報， 2002， 37（10）： 4-6.

[19] Gunnell P S， Gubler W D. Taxonomy and morphology of Colletotrichum species pathogenic to strawberry[J]. Mycologia， 1992， 84（2）： 157-165.

[20] Smith B J， Black L L. Morphological， cultural and pathogenic variation among Colletotrichum species isolated from strawberry[J]. Plant Disease， 1990， 74（1）： 69-76.

[21] Denoyes B， Baudry A. Species identification and pathogenicity study of French Colletotrichum strains isolated from strawberry using morphological and cultural characteristics[J]. Phytopathology， 1995， 85（1）： 53-57.