超聲波輔助提取銅錘玉帶草莖葉黃酮類化合物的工藝研究

劉倫沛　劉立波　邵顯會　廖芳

摘要[目的]研究超聲波輔助提取銅錘玉帶草莖葉黃酮類化合物的最優(yōu)工藝。[方法]以濃度70%乙醇為溶劑，采用超聲波作輔助提取設備，通過單因子試驗確定影響黃酮類化合物提取的主要因素及其最佳水平范圍，并通過L9（34）正交試驗確定最優(yōu)提取條件。[結果]影響銅錘玉帶草莖葉黃酮類化合物提取的因素主次為：超聲波功率>浸提溫度>提取時間>料液比；最優(yōu)工藝條件為：超聲波功率350 W，浸提溫度60 ℃，提取時間30 min，料液比1∶20（g/ml）；在該工藝條件下，銅錘玉帶草莖葉黃酮類化合物的含量為38.437 mg/g。[結論]試驗得出的最優(yōu)工藝條件可為銅錘玉帶草的開發(fā)利用提供依據(jù)。

關鍵詞銅錘玉帶草（Pratia begoniifolia Lindl.）；黃酮類化合物； 超聲波； 提取工藝

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）07-01933-03

基金項目凱里學院教授專項科研項目（JS201310）；貴州省重點支持學科——植物學建設項目（黔教高發(fā)〔2011〕275號）；凱里學院生物科學專業(yè)基礎課教學團隊建設項目（JXTD201003）。

作者簡介劉倫沛（1967-），男，貴州岑鞏人，教授，碩士，從事生物化學、植物生理學的教學及生物資源開發(fā)與利用研究。

收稿日期20140210銅錘玉帶草（Pratia begoniifolia Lindl.）為桔梗科銅錘玉帶草屬（Pratia）多年生平臥草本植物，又名小銅錘、地鈕子、地石榴，主要分布于西南、華南、湖南、湖北、江西、浙江、福建、臺灣、越南和印度等地，大多野生于海拔300～2 300 m的丘陵、陰濕田坎、低山草坡或疏林中[1]。

銅錘玉帶草是我國民間一種重要中草藥，以全草入藥，具有利水消腫和解毒的功效，臨床用于治療急性腎炎、尿路感染和療瘡腫毒等。其果實味苦澀，性微溫，能補腎強精，用于遺精、白帶及小兒疳積等輔助治療。云南民間用全草治療風濕疼痛、跌打損傷、乳癰和無名腫痛等[2-3]，佤族將其用于治療口腔潰爛癥[4-5]。經(jīng)生藥學鑒定和化學成分分析，銅錘玉帶草含有黃酮類、酚類、甾醇、氨基酸和高級脂肪酸酯等成分[6]，具有較高營養(yǎng)價值和保健價值。因其風味獨特，是一種頗受人們青睞的野菜，現(xiàn)已逐漸成為賓館、酒店的時尚菜。近年來，人們對銅錘玉帶草進行組織培養(yǎng)和人工種植，取得較好的經(jīng)濟效益[7-9]。另外，該植物對土壤適應性比較強，具有耐旱、耐寒和抗病等特點，也成為一種園林地被植物。試驗以銅錘玉帶草全草為材料，研究其黃酮類化合物的提取工藝，以期為進一步開發(fā)利用銅錘玉帶草提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。銅錘玉帶草，于2013年8月15月采于貴州省丹寨縣韭菜溝老冬寨林場溪溝邊，標本貯存于凱里學院環(huán)境與生命科學學院植物生理學實驗室。

1.1.2主要儀器。RE52 A 型旋轉蒸發(fā)器，購自上海亞榮生化儀器廠；SHBⅢ 型循環(huán)水式真空泵，購自河南省鞏義市英峪予華儀器廠；JYCCQ 超聲波萃取儀，購自上海矩源機械設備有限公司；DS250 A型超聲波清洗器，購自寧波市海曙達盛超聲波儀器廠；電熱恒溫真空干燥箱，購自上海博迅實業(yè)有限公司；TU1800 型紫外-可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；電子分析天平，購自上海精密科學儀器有限公司。

1.1.3主要試劑。蘆丁標樣，購自中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚（沸程30～60 ℃）、無水乙醇等試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1樣品的初處理。將采于貴州省丹寨縣銅錘玉帶草洗凈，涼干，置于70 ℃電熱恒溫真空干燥箱中烘干，搗碎并過40目篩，存放于干燥器中備用。

1.2.2提取工藝流程。銅錘玉帶草供試樣品→濃度70%乙醇浸泡12 h →超聲波輔助水浴加熱浸提→ 抽濾→濾液濃縮→定容50 ml→取5.00 ml作5倍稀釋（待測液）。

1.2.3線性關系的考察。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定[10-14]。即準確稱取經(jīng) 120 ℃干燥至恒重的無水蘆丁0.025 0 g，用濃度70%的乙醇溶解并定容至 100 ml，搖勻得蘆丁標準品母液。分別吸取蘆丁標準品母液 0、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50 ml于10 ml干凈的比色管中，加入0.30 ml濃度5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置 6 min；然后加入0.30 ml濃度10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置 6 min；再加入4.00 ml濃度4%的氫氧化鈉溶液，搖勻；最后用濃度70%乙醇溶液稀釋到刻度，搖勻后靜置15 min，用紫外-可見分光光度計測定510 nm處的吸光值（注：蘆丁標準品溶液與銅錘玉帶草樣品總黃酮提取液經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色反應后的掃描光譜得知，兩者在可見光區(qū)的最大吸收波長均為510 nm），計算線性回歸方程。

1.2.4黃酮類化合物含量測定。吸取樣品提取待測液 1.00 ml，于10 ml干凈的比色管中，同“線性關系的考察”操作步驟，用紫外-可見分光光度計測定 510 nm處的吸光值，通過回歸方程計算樣品黃酮類化合物的含量。2個重復，取平均值。

1.2.5銅錘玉帶草黃酮類化合物提取單因素試驗。稱取一定量的銅錘玉帶草供試樣品，按照提取工藝流程，選擇超聲波功率、乙醇濃度、提取時間、料液比和浸提溫度等因素作單因子試驗，提取液經(jīng)50 ml容量瓶定容，再作5倍稀釋，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色，測定其510 nm處的吸光值，計算黃酮類化合物含量，以此為指標，考察各因素對銅錘玉帶草莖葉黃酮類化合物提取的影響。（1）超聲波功率對黃酮類化合物提取的影響。分別稱取供試樣品2.000 g，加入60 ml濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，分別用200、250、300、350、400、450、500、550和600 W的超聲波在50 ℃水浴中輔助提取30 min，經(jīng)過濾、定容、稀釋和測定其吸光值，計算樣品中黃酮類化合物的含量。（2）乙醇濃度對黃酮類化合物提取的影響。分別稱取供試樣品2.000 g，按照提取工藝流程，分別用不同濃度的乙醇60 ml，在50 ℃水浴中用350 W的超聲波輔助提取30 min，經(jīng)過濾、定容、稀釋和測定其吸光值，計算樣品中黃酮類化合物的含量。（3）提取時間對黃酮類化合物提取的影響。分別稱取供試樣品2.000 g，加入60 ml濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，在50 ℃水浴用350 W超聲波分別輔助提取10、20、30 、40、50和60 min，經(jīng)過濾、定容、稀釋和測定其吸光值，計算其黃酮類化合物含量。（4）料液比對黃酮類化合物提取的影響。分別稱取供試樣品2.000 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g/ml，W/V，下同）加入濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，在50 ℃水浴用350 W超聲波輔助提取30 min，經(jīng)過濾、定容、稀釋和測定其吸光值，計算樣品中黃酮類化合物含量。（5）浸提溫度對黃酮類化合物提取的影響。分別稱取供試樣品 2.000 g，加入60 ml濃度70%的乙醇，按照提取工藝流程，在不同的溫度條件下用350 W超聲波分別輔助浸提30 min，經(jīng)過濾、定容、稀釋和測定其吸光值，計算樣品中黃酮類化合物的含量。

1.2.6銅錘玉帶草黃酮類化合物提取正交試驗。為進一步研究超聲波輔助提取銅錘玉帶草黃酮類化合物的優(yōu)化條件，根據(jù)單因素試驗結果，選擇超聲波功率、料液比、浸提溫度和提取時間這4個因素，用L9（34）正交試驗進行試驗設計，提取其黃酮類化合物，測定其510 nm處的光吸光值和計算黃酮含量。以黃酮類化合物含量為考察指標，全面研究這4個因素的交叉作用對其黃酮類化合物提取的影響，各因素水平如表1所示。

2結果與分析

2.1線性關系的考察計算得線性回歸方程為：Y=0.008 71X+0.003 62，相關系數(shù)R為0.999 93。試驗結果表明，在0～0.062 5 mg/ml范圍內，蘆丁（黃酮）的質量濃度在所配制的梯度范圍內，吸光度與黃酮質量濃度有很好的線性關系，即可按此法定量測定黃酮類化合物。