農桿菌介導的黃瓜未受精子房培養遺傳轉化體系的建立

魏愛民 杜勝利 韓毅科 劉楠

摘 要： 為了建立一種直接獲得轉基因純系的轉化方法，首次開展了農桿菌介導的黃瓜未受精子房培養遺傳轉化體系研究。試驗以除草劑草胺膦為選擇標記，胚胎發生階段，最適除草劑質量濃度為0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根階段除草劑質量濃度為2.0 mg·L-1；以羧芐青霉素為抑菌劑，最適抑菌質量為450 mg·L-1；最佳浸染方法為OD600=0.3農桿菌工程菌，浸染10 min；共培養時間為3 d；在浸染菌液和共培養基中加入0.01% 的silwet-77，有利于獲得較多抗性胚胎及抗性植株。該遺傳轉化體系的建立，為黃瓜轉基因方法研究開辟了新途徑。

關鍵詞： 黃瓜； 未受精子房； 農桿菌； 轉化體系

黃瓜是我國人民喜食的蔬菜之一，消費量大，種植面積廣。近年，隨著人民生活水平的提高，對黃瓜新品種提出了更高要求。由于黃瓜遺傳基礎狹窄，依靠現有材料很難選育出商品性、抗病性、品質性狀等方面均具有突破性的新品種。基因工程方法可以創造性地獲得新材料，特別是通過常規育種方法不能獲得的育種新材料。基因工程技術在水稻品種改良上得到了廣泛的應用，我國已成功選育了抗蟲、抗除草劑、抗病、養分高效、耐鹽和高產等一系列轉基因水稻品系/組合[1]。

黃瓜轉基因研究開始于上世紀90年代，研究者對遺傳轉化體系進行了大量研究，應用較多的轉化方法主要為：以體細胞再生體系為基礎的農桿菌介導法[2-4]、花粉管通道法[5-6]，研究者已對黃瓜抗病[7]、抗蟲[8]、抗逆[9]、品質[10]、產量[4]等相關性狀基因進行目的基因轉化研究。但上述轉基因研究中存在轉化率低、基因型差異明顯、轉化體多為嵌合體、多代篩選才能獲得抗性純合株系、重復性差等問題。目前，黃瓜的轉基因研究尚未應用于育種實踐。

黃瓜未受精子房培養技術已獲得成功，并進行育種應用[11]。該方法通過離體培養未受精子房，誘導離體雌核發育，并自然加倍形成雙單倍體植株，直接獲得性狀純合的育種材料，育種效率大幅提高，最高離體雌核胚胎發生頻率為85%，植株再生頻率為25%。本研究擬應用黃瓜未受精子房培養技術體系，進行農桿菌介導的遺傳轉化方法研究，旨在建立一種直接獲得轉基因純系的轉化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 黃瓜未受精子房培養高再生頻率基因型材料W6。

1.1.2 載體及菌株 質粒載體：pCAMBIA3301，含有抗除草劑Bar基因。農桿菌工程菌株：含質粒載體的EHA105農桿菌工程菌。

1.2 方法

1.2.1 轉化方法 采集開花前2～3 d的黃瓜未受精子房，用70%酒精表面滅菌后，再用10%次氯酸鈉滅菌15～20 min，無菌水沖洗4次，無菌條件下，將幼嫩子房自頂部中心部位縱切或橫切若干小塊，備用。向OD值為0.2～0.5的稀釋農桿菌工程菌液（經過2次搖菌后收集離心沉淀物重懸）中加入AS 50～100 [μ]mol·L-1、silwet-77等，浸染未受精子房5～20 min，期間不停搖動，使菌液與外植體充分接觸。以無菌濾紙充分吸干外植體表面殘存菌液，平放入誘導培養基，黑暗中共培養1～4 d，之后轉接至含除草劑的選擇培養基中，抗性芽高于1.5 cm時，轉入生根培養基使其長成完整植株。

采用MS基本培養基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH 5.8；外植體置于組培室內培養，溫度25～27 ℃，光/暗為16 h/8 h。外植體不同培養階段使用的培養基為：（1）誘導培養基（共培養培養基）：MS+BA 0.5～1.0 mg·L-1；（2）抗性胚胎選擇培養基：MS+ BA 0.5～2.0 mg·L-1+除草劑 0.5～1.0 mg·L-1+羧芐青霉素 450 mg·L-1；（3）生根培養基：1/2MS+除草劑 2.0 mg·L-1+羧芐青霉素 450 mg·L-1。

1.2.2 除草劑質量濃度的確定 胚胎誘導階段除草劑篩選質量濃度的確定：在黃瓜未受精子房培養誘導培養基中添加0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1的除草劑，比較其對未受精子房培養胚胎發生的影響，確定以除草劑進行轉化體篩選的臨界濃度。再生植株生根階段除草劑篩選質量濃度的確定：將11 d苗齡的無菌苗，剪掉根系扦插于含有不同濃度除草劑的生根培養基中，研究除草劑濃度對幼苗生根的影響，確定以除草劑進行轉基因再生小植株篩選的臨界濃度。

1.2.3 不同質量濃度抗生素對黃瓜未受精子房胚胎發生的影響 在黃瓜未受精子房培養誘導培養基中添加0、150、300、450、600 mg·L-1的羧芐青霉素，比較其對未受精子房培養胚胎發生的影響，確定農桿菌浸染后適宜的抑菌濃度。

1.2.4 影響農桿菌介導的未受精子房遺傳轉化體系的因素研究 （1）農桿菌浸染方法研究：比較不同菌液濃度、浸泡時間等因素對未受精子房浸染后農桿菌抑菌效果的影響。（2）浸染菌液中添加不同濃度的silwet-77對轉化體系胚胎及植株再生的影響：浸染菌液中添加濃度為0、0.01%、0.05% 的silwet-77，比較其對黃瓜未受精子房培養遺傳轉化體系胚胎及植株再生的影響。（3）共培養不同時間對轉化體系胚胎及植株再生的影響：分別比較共培養2、3、4 d 對黃瓜未受精子房培養遺傳轉化體系胚胎及植株再生的影響。

1.2.5 數據統計 除草劑質量濃度、抗生素抑菌質量濃度的確定試驗，每個處理浸染30個子房，3次重復；幼苗生根階段除草劑質量濃度試驗，每處理4株幼苗，3次重復；農桿菌浸染方法研究每處理3次重復，每處理共100個子房；共培養時間、silwet-77對轉化體系的影響比較試驗，每處理100個子房，未做重復。試驗數據采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。數據計算公式：

胚胎發生率/%= 發生胚胎（抗性胚胎）數/接種子房數×100

植株再生率/%= 再生抗性植株數/接種子房數×100

生根率/%=生根植株數/幼苗數×100

萎蔫率/%=萎蔫株數/幼苗數×100

2 結果與分析

2.1 未受精子房培養遺傳轉化體系除草劑質量濃度的確定

2.1.1 胚胎誘導階段除草劑質量濃度的確定 由表1可見：黃瓜未受精子房對除草劑比較敏感，較低濃度即可明顯抑制未受精子房胚胎發生，隨著除草劑質量濃度升高，胚胎發生頻率呈明顯下降趨

勢。當除草劑質量濃度為0.50 mg·L-1時，胚胎發生率為18.9%，顯著低于對照；當除草劑質量濃度高于1.00 mg·L-1即不能誘導胚胎發生。因此確定除草劑質量濃度0.50～1.00 mg·L-1之間，作為篩選除草劑抗性胚胎的臨界濃度。

2.1.2 再生植株生根過程除草劑篩選質量濃度的確定 從表2可見：隨著除草劑質量濃度的加大，植株生根及根生長受到明顯抑制。當除草劑質量濃度為0.5 mg·L-1時，生根率較高，沒有萎蔫植株；當除草劑質量濃度為2.0 mg·L-1時，生根率僅為33.3%，根長為0.3～1.0 cm，萎蔫死亡植株率為75.0%，此時，生根率低，萎蔫率高，明顯低于或高于50%的臨界標準。高于2.5 mg·L-1時，生根率下降明顯，萎蔫率保持高值。因此確定幼苗期除草劑抗性植株篩選質量濃度為2.0 mg·L-1。

2.2 不同質量濃度抗生素對黃瓜未受精子房胚胎發生的影響

羧芐青霉素是黃瓜轉基因研究中常用的脫菌劑，初期抑菌質量濃度常為200～300 mg·L-1。誘導培養基中加入羧芐青霉素，會對黃瓜未受精子房培養胚胎發生產生影響。當誘導培養基中加入抗生素質量濃度低于450 mg·L-1時，未受精子房胚胎發生率略低于對照，當高于600 mg·L-1時，胚胎發生率顯著下降，與其他組分處理差異顯著（表3）。為了能有效抑菌而又不影響胚胎發生，因此在農桿菌介導的黃瓜未受精子房培養遺傳轉化研究中適宜的抑菌質量濃度為450 mg·L-1。

2.3 農桿菌介導的黃瓜未受精子房培養遺傳轉化體系的初步建立

2.3.1 農桿菌浸染方法研究 以未受精子房為外植體進行農桿菌介導的遺傳轉化研究時，由于未受精子房壁體細胞組織在培養初期即發生體細胞凋亡，生命力衰退，易被農桿菌感染，導致抑菌困難。針對該技術難題，本實驗比較了菌液濃度、浸染時間的不同組合對未受精子房浸染后，抑菌效果及胚胎發生的影響（表4）。

從表4可見，當浸染菌液濃度較低時（OD600=0.3），浸染的未受精子房接種后污染率明顯低于高濃度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液濃度為OD600=0.3，浸染10 min時，污染率明顯低于同濃度菌液浸染外植體20 min，為22%。當浸染菌液濃度較低時（OD600=0.3），胚胎發生率高于高濃度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液濃度為OD600=0.3，浸染10 min時，胚胎再生率明顯高于高濃度浸染菌液（OD600=0.6），為39.7%。因此，確定以農桿菌工程菌OD600=0.3，浸染10 min作為轉化的基本方法。

2.3.2 共培養時間對遺傳轉化的影響 農桿菌菌液浸染未受精子房后，共培養時間的長短，直接影響獲得轉化體數量的多少，以及抗生素抑菌效果。試驗分別比較了共培養2、3、4 d對黃瓜未受精子房培養胚胎及植株再生的影響。

結果表明（表5）：隨著共培養時間的延長，除草劑抗性篩選過程抑菌難度逐漸加大。共培養4 d時，外植體污染率為80%，明顯高于共培養2、3 d時，且未獲得再生胚胎。共培養2、3 d時，外植體污染率、胚胎發生率、植株再生率均無較大差異；其中，共培養3 d時，胚胎、植株再生率略高于共培養2 d時的結果。考慮到較長的共培養時間可能有利于外源基因轉化，因此以共培養3 d為好。

2.3.3 菌液中加入表面活性劑silwet-77對黃瓜未受精子房培養遺傳轉化的影響 Silwet-77作為一種表面活性劑，常用于Floral dip 遺傳轉化中，以增強浸染菌液的滲透能力。黃瓜離體雌核發育為未受精子房胚囊內細胞發生分裂、形成胚胎。胚囊組織被多層子房壁、珠被等體細胞包裹，不利于農桿菌滲透入胚囊細胞，完成轉化。因此，本研究比較了浸染菌液及共培養培養基中加入不同濃度的silwet-77對未受精子房培養遺傳轉化的影響。

由表6可見，菌液及共培養培養基中加入不同濃度的silwet-77后，隨著silwet-77濃度的增加，除草劑抗性篩選過程，外植體污染率呈明顯上升趨勢。當silwet-77濃度為0.01%時，抗性胚胎發生率及植株再生率高于對照；當silwet-77濃度為0.05%時，胚胎發生率及植株再生率明顯低于對照。可見，菌液及共培養基中加入低濃度silwet-77，抗性篩選時農桿菌較易被控制；適當濃度的silwet-77對胚胎發生及轉化率的影響有待進一步研究。

3 討 論

胚囊被認為是遺傳工程的理想受體[12]，其原因主要為：胚囊內細胞具有天然原生質體的結構，有利于外源基因的引入；胚囊內的卵細胞正處于一個世代交替的轉折階段，是易受外來物質影響的敏感時期；卵器細胞再生力強，有利于轉化細胞再生成植株；胚囊體積大、結構特殊，有利于進行微量注射引入外源DNA。因此，研究者以子房為轉化受體，通過子房注射法、Floral dip等方法，已在棉花[13]、玉米[14]、擬南芥[15]、油菜[16]等作物獲得轉基因植株。黃瓜未受精子房培養技術，可直接獲得育種應用的純系，從而大幅提高育種效率，目前，國內外僅少數單位擁有該項技術并實現規模化應用。本研究應用已建立的高效黃瓜未受精子房培養技術，探索以胚囊內細胞為轉化受體進行轉基因研究，尚未見報道。

試驗分別研究了黃瓜未受精子房胚胎發生及幼苗階段除草劑質量濃度，發現黃瓜植株對除草劑表現敏感，極低濃度可產生藥害。黃瓜未受精子房培養不同發育階段，對除草劑質量濃度的耐受性不同，胚胎誘導階段除草劑質量濃度為0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根階段為2.0 mg·L-1。賴來等[17]以黃瓜子葉為外植體進行農桿菌介導的遺傳轉化研究，在抗性芽誘導階段與幼苗生根階段，分別采用不同質量濃度的除草劑進行篩選，其中幼苗生根階段除草劑質量濃度為2.0 mg·L-1，與本研究結果一致。

抑菌困難，是研究建立黃瓜未受精子房遺傳轉化體系必須解決的關鍵問題之一，其污染原因主要為農桿菌不能有效抑制以及接種材料滅菌不徹底。本研究初步比較了不同菌液濃度、處理時間對選擇培養抑菌程度的影響。確定OD600=0.3時，浸染10 min，作為農桿菌浸染未受精子房的最佳方法，該方法依然存在轉化處理后胚胎再生率較低，存在一定污染等問題。針對該問題，可進一步開展菌液濃度、處理時間等轉化方法對抑菌效果影響的比較試驗；探索頭孢霉素等其他抗生素對未受精子房培養胚胎發生及抑菌效果的影響。對于來源于材料本身的雜菌污染，后續試驗可在材料盛花早期集中進行，此時材料新鮮，易于滅菌；也可適當延長材料滅菌時間，確保材料沒有雜菌污染；或先采用短期預培養，再進行轉化處理，對選擇培養時農桿菌抑菌，可能會有好的作用。

Floral dip轉化方法是一種以活體植株生殖細胞為轉化體的轉化方法，Silwet-77是Floral dip 遺傳轉化中有效的表面活性劑[18]。有試驗表明將Silwet-77添加入農桿菌菌液，采用涂抹或浸泡黃瓜幼嫩子房進行轉化處理，有利于提高轉化效率[19]。本研究方法在離體條件下以未受精子房為轉化體，與上述方法有相似之處。本研究中加入Silwet-77后，隨Silwet-77濃度的增加，外植體污染率上升，說明浸染菌液對外植體內部組織的浸染能力增強。另外，當silwet-77 濃度較高時（0.05%），胚胎發生率及植株再生率降低，且明顯低于對照；當silwet-77 濃度較低時（0.01%），胚胎發生率及植株再生率略高于對照。Silwet-77對胚囊內細胞生長發育的影響，有待通過細化試驗設計進一步研究。找到適當濃度的Silwet-77，有可能提高農桿菌介導的未受精子房轉化方法的轉化率。

本研究初步建立了黃瓜未受精子房遺傳轉化體系，但該體系存在轉化處理后胚胎再生率、植株再生率低等問題，直接影響轉基因植株的獲得。后續完善試驗在轉化體篩選過程中可進行延遲篩選，或采用初期低質量濃度、后期高質量濃度的方法，以獲得更多轉化植株。

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