轉融合基因CrylAb/Ac水稻稻桿對泥鰍蛋白水解酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響

李菲 劉雨芳 孫遠東 譚樹華 肖璐 劉文海 莫書銀 桂芳艷

摘 要：為探索轉Bt抗蟲水稻對泥鰍的毒性作用，采用水體中添加不同濃度（10.50、100、200mg/L）的轉融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號（HHl）稻桿粉飼養泥鰍，非轉基因親本明恢63（MH63）作對照，不加稻桿粉為空白對照，分析了對泥鰍蛋白水解酶、乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響。研究發現：經4個濃度處理后，泥鰍的胃蛋白水解酶、腸蛋白水解酶和腦AChE、肝臟AChE、肌肉AChE與對照組泥鰍相比均無顯著差異（n=3，P>0.05）。高濃度（200mg/L） HH1、MH63組泥鰍胃蛋白水解酶與空白對照相比均顯著降低（n=3，P<0.05）；低濃度（1Omg/L）HH1組泥鰍肝臟AChE與空白對照差異顯著（n=3，P<0.05）；不同濃度HH1、MH63稻桿粉對泥鰍的腸蛋白水解酶、腦AChE和肌肉AChE均無顯著影響（n=3，P>0.05）。結果表明：HH1水稻稻桿粉對泥鰍的消化道蛋白酶和乙酰膽堿酯酶沒有影響，而水體中高劑量的HH1或MH63稻桿粉均會降低泥鰍胃的消化能力。

關鍵詞：轉融合基因CrylAb/Ac水稻；泥鰍；蛋白水解酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號：Q142.8

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0189-06

轉Bt基因抗蟲水稻通過靶標害蟲取食殺蟲晶體蛋白，在昆蟲堿性腸道內溶解，與中腸膜受體結合，引起細胞溶解，導致昆蟲停止進食而致死的方式[1]，對二化螟（Chilo suppressalis）、三化螟（Try-Poryza，incerlulas）和稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocismedinalis）等鱗翅目害蟲具有高度特異抗性，其應用能有效降低水稻受蟲害侵襲造成的損失，減少化學殺蟲劑帶來的環境問題[2-4]。我國相繼成功培育“克螟稻”和“華恢l號”等轉Bt基因抗蟲水稻，“華恢1號”于2009年獲得農業部批準安全證書（農基安證字（2009）第072號），極有可能有力推動轉基因抗蟲水稻商業化種植，與此同時，由此可臺能引發的生態安全問題也再次成為公眾關注的熱點。

大量的田間調查顯示，轉Bt抗蟲水稻對非靶標害蟲白背飛虱（Sogatella furcifera）、黑尾葉蟬（Nephotettix cincticeps）的種群發生動態沒有明顯影響[5，6]；對食蟲溝瘤蛛（Ummeliata insecticeps）、黑肩綠盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）等捕食性天敵的物種豐富度和多樣性[7，8]、稻田節肢動物群落的物種組成及豐富度、多樣性[9，10]沒有顯著影響，但寄生蜂等天敵的數量明顯降低[11，12]。轉Bt抗蟲水稻對土壤動物的安全性評價也有大量報道，如轉Bt抗蟲水稻種植后彈尾蟲的種類與豐富度沒有受到明顯影響[13]；而田間土壤跳蟲總量受到一定程度的影響，但對其群落多樣性、均勻度和物種豐富度影響不顯著[14]，土壤線蟲數量及植物寄生線蟲成熟度在轉Bt抗蟲水稻短期種植下沒有顯著影響[15]。已有文獻表明轉Bt抗蟲水稻的安全性評價多偏向于對地上或土壤生物的研究，缺乏對稻田水生生物與水體生態環境的毒性作用的評價研究，不能全面反映轉基因水稻的生態安全性。

在我國南方“稻一魚”互作的生態農業模式中，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），作為水稻田中主要的淡水魚，通過覓食、潛穴等游動行為對稻田水生生態系統的結構與功能起到良好的改善作用[16]：同時，泥鰍對水體不良脅迫反應靈敏，如吳若菁等研究了SO2衍生物、殺蟲劑、蘇丹紅Ⅲ等對泥鰍的急性毒性、遺傳損傷和生理酶活性的影響[17～19]，均顯示泥鰍在評價水體污染物對水生生物的毒理效應中可作為良好的指示生物。因此，本研究以泥鰍為指示生物，以轉融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號及其對應親本為實驗材料，基于室內調控試驗，開展轉基因水稻稻桿粉對泥鰍的消化能力、神經傳遞的致害性比較研究，以期評價轉Bt抗蟲水稻秸稈物對泥鰍生理生化功能的影響，為進一步了解轉Bt抗蟲水稻對魚類的影響提供科學依據。

1材料與方法

1.1供試水稻與稻桿取樣

試驗水稻種為轉融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號（簡稱HH1），及其親本對照明恢63（簡稱MH63）。

2012年6月，在湖南省湘潭市湖南科技大學國家農業部重大專項實驗基地內，將試驗田分成6塊等面積小區，轉Bt水稻HH1及其親本MH63交替種植，各設3個重復。種植期間不施用化學殺蟲劑與除草劑，其余水肥按常規農事操作與管理。于水稻成熟期（10月），隨機選取不同品種稻株，去除稻穗，留下水稻植株遠根處10cm莖干，保鮮袋分裝，帶回實驗室，晾干粉碎，制成稻桿粉，-20℃冷藏備用。

1.2供試泥鰍

泥鰍購自湖南省湘潭市潤田水產養殖有限公司，殺菌消毒后，于水族箱（70cmx65cmx50cm）內馴養，用水為充分曝氣除氯（1d）的自來水，投喂飼料購自湖南省湘潭市潤田水產養殖有限公司，飼料主要成分為粗蛋白（340/0）、粗纖維（17%）、灰分（17%）、食鹽（4%）、總磷（2.2%）、鈣（4%）、賴氨酸（1.5%）、蛋氨酸（0.2%）、水分（lO%）等。

1.3泥鰍飼喂設計

挑選健康活躍、體表無損傷的規格泥鰍45尾，測得初始平均體長為（7.69±0.08）cm，平均體重為（1.70±0.07）g，隨機分成9組，每組5個重復，于容積1L的燒杯中單尾飼養（盛充氣24h自來水800mL），加HH1稻稈粉為試驗組（4組），加MH63稻稈粉為對照組（4組），1組不添加任何稻桿粉為空門對照。

泥鰍飼養于人工氣候室內（100d），溫度（23±1）℃，光周期（10L：14D）。期間每天定時換水，添加稻桿粉并喂食，投餌量為泥鰍初始體重的4%.根據國家漁業水質標準GB11607-89，漁業標準懸浮物質<10mg/L，稻桿粉設4個濃度，分別為10、50、100、200mg/L。

以水體pH和溶氧量（DO）為指標，測定了試驗用水在投放稻桿粉飼養泥鰍24h始末的理化性質.酸堿度測定采用PH-033 waterproof Pen-type pH Meter，溶解氧含量測定采用碘量法（表1）。

1.4酶液制備與酶活性測定

飼養試驗結束后，活體解剖泥鰍，取其腦、肝臟、肌肉、胃和腸組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干、稱重，進行粗酶液制備。胃和腸組織按照質量體積比1：8加人生理鹽水（4℃），冰浴勻漿，勻漿液靜置1h后（4℃），以7000r/min在4℃下離心20min，取上清液作為蛋白水解酶待測液。腦、肝臟和肌肉按照質量體積比1：10加入pH8.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，冰浴勻漿，勻漿液于高速冷凍離心機上以10000r/min離心30 min（4℃），取上清液作為乙酰膽堿酯酶待測液。

蛋白水解酶活性f201測定采用福林一酚試劑法，酶活性定義為每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸為一個蛋白酶活力單位。乙酰膽堿酯酶活性[21]測定采用Ellman法，酶活力定義為每毫克腦（肝臟、肌肉）組織每分鐘水解底物的摩爾數。

1.5數據分析

應用SPSS13.0統計軟件，經Shapiro-Wilk和Levene對數據進行正態性及方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較平行組間轉基因水稻品種和親本對照泥鰍酶活性的差異。運用Duncan's多重檢驗法分析每一品種水稻不同稻桿粉濃度處理組與空白對照之間的差異顯著性。

2結果

2.1胃蛋白水解酶

經兩個品種不同濃度的稻桿粉喂養后，泥鰍的胃蛋白水解酶均隨稻桿粉濃度增加明顯降低，但HH1與MH63平行組間沒有顯著差異（表2）。10mg/L與200mg/L稻桿粉處理后，HH1組泥鰍胃蛋白水解酶略高于MH63（n=3，P>0.05）；50mg/L、100mg/L稻桿粉處理后泥鰍胃蛋白水解酶均略低于對照MH63 （n=3，P>0.05）。而添加HH1、MH63稻桿粉后，泥鰍的胃蛋門水解酶均不同程度地低于空白對照，其中，高濃度（200mg/L）HHl與MH63組泥鰍均顯著低于空白對照（n=3，P<0.05）（圖1）。

圖1 HH1稻桿粉對泥鰍胃蛋白水解酶的影響

圖中數據標注為平均值±標準誤（n=3）；不同小寫字母表示同一品種稻桿粉的不同濃度處理之間的差異顯著（P<0.05）。圖2—5同。

Fig.l Effects of HHl straw powder on activity of pro-teolytic enzyme in stomach of M.anguillicaudatus

Bar charts （x±Sx） with different lowercase letters mean thesignificant difference in vanous concentration of the samerice straw powder（P<0.05）. Same with Fig.2～5。

2.2腸蛋白水解酶

與對照MH63相比，不同濃度的HH1稻桿粉處理后，泥鰍的腸蛋白水解酶沒有顯著變化（表2）。其中，10mg/L、50mg/L HH1組略低于MH63（n=3，P>0.05）；100mg/L、200mg/L HH1組略高于MH63（n=3，P>0.05）。與空白對照相比，HH1組與MH63組泥鰍的腸蛋白水解酶均隨稻桿粉濃度增加而逐漸降低，但差異不顯著（n=3，P>0.05）（圖2）。

圖2HH1稻桿粉對泥鰍腸蛋白水解酶的影響

Fig.2

Effects of HHl straw powder on activity of prote-olytic enzyme in intestine of M. anguillicaudatus

2.3腦部乙酰膽堿酯酶

10mg/L HH1組泥鰍腦部的AChE活性略低于對照MH63，但無顯著差異（n=3，P>0.05）；中高濃度（50、100、200mg/L）HHl組泥鰍腦部AChE活性均略高于MH63，無顯著差異（n=3，P>0.05）（表2）。而經不同濃度HH1、MH63稻桿粉處理后，泥鰍腦部的AChE活性均略高于空白組，但沒達到顯著差異（n=3，P>0.05）（圖3）。

圖3 HH1稻桿粉對泥鰍腦部乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.3 Effects of HHl straw powder on activity of AChEin brain of M.anguillicaudatus

2.4肝臟乙酰膽堿酯酶

從圖4可以看出，不同濃度的HH1稻桿粉對泥鰍肝臟的AChE活性與MH63相比沒有顯著影響（表2），且HH1組與MH63組泥鰍肝臟AChE活性變化趨勢相似，均隨稻桿粉濃度增加而逐漸降低且始終高于空白對照，其中，10 mg/L HH1組顯著高于空白組（n=3，P<0.05）。

圖4 HH1稻桿粉對泥鰍肝臟乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.4

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin liver of M.anguillicaudatus

2.5肌肉乙酰膽堿酯酶

與MH63組相比，4個濃度水平的HH1稻桿粉處理對泥鰍肌肉AChE活性沒有顯著影響（表2）。經10、50mg/L稻桿粉處理后，HH1組泥鰍肌肉AChE活性不同程度地高于對照MH63 （n=3，P>0.05）；而100、200mg/L HH1組略低于MH63組（n=3，P>0.05）。HH1組、MH63組與空白對照均無顯著差異性（n=3，P>0.05）（圖5）。

圖5 HH1稻桿粉對泥鰍肌肉乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.5

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin muscle of M.anguillicaudatus

3討論

3.1轉Bt水稻對泥鰍蛋白水解酶的影響

泥鰍屬雜食性魚類，水體中適度的稻桿粉可增加泥鰍食源的豐富度促進取食，蛋白水解酶的主要功能是將食物中的蛋白質分解為小的肽片段，其活性高低可直接影響動物的生長狀況[22]。實驗結果表明，稻桿粉濃度相同時，HH1水稻對泥鰍的胃、腸蛋白水解酶與MH63相比沒有顯著影響，但均隨稻桿粉濃度的增加呈下降趨勢，說明泥鰍的消化道蛋白酶活性與稻桿粉品種沒有直接關聯，而受濃度的影響。

注：表中F值為組間均方與組內均方之比，表示F檢驗水平。P值代表顯著性差異水平，P>0.05時，表示HH1組均數與MH63組均數之間無顯著性差異。

Notes：Values of F in the table shows the analysis of variance level， for the ratio of the groups mean squareand within group.Values of P represents the level of significant difference， P>0.05 means no significant dif-ference belween the HHl group and MH63 group。

有胃魚中胃是主要的消化器官，本實驗中泥鰍的胃蛋白水解酶活性遠遠高于腸蛋白水解酶，這與Ana等對魚類蛋白酶活性的研究結果一致[23～25]。少量的稻桿粉進入泥鰍胃部，胃腺分泌蛋白水解酶、纖維素酶、淀粉酶等消化酶促進食物的分解，當雜食性魚類取食植物性食物時淀粉酶分泌較多，因此試驗中低濃度處的胃蛋白水解酶活性均略低于空白對照。但大量的稻桿粉會使水體pH和溶解氧等環境惡化，且較多的懸浮物會阻礙泥鰍的呼吸與濾食，直接影響泥鰍的正常取食與蛋白酶活性，使得高濃度組泥鰍胃蛋白水解酶活性顯著降低。由于稻桿粉經胃部分解后進入腸道的含量較少，因此HH1或MH63組泥鰍腸蛋白水解酶均受影響程度較弱。總之，在本實驗設定的稻桿粉濃度水平內，相同濃度的HH1與MH63組間泥鰍胃蛋白水解酶、腸蛋白水解酶沒有顯著差異。

3.2轉Bt水稻對泥鰍乙酰膽堿酯酶的影響

郭文娟用轉CrylAb/Ac基因水稻莖干飼喂靶標害蟲大螟后其體內AChE活性顯著降低[26]，周穎研究表明轉CrylAb基因水稻對蜘蛛體內AChE活性沒有影響[27]，肖能文用CrylAc蛋白人造土壤處理赤子愛勝蚓也表明對其AChE活性沒有影響[28]。本實驗結果表明，水體添加10～200mg/L稻桿粉后泥鰍腦、肝臟和肌肉的AChE酶活性與非轉基因對照無顯著差異。

乙酰膽堿是促進突觸傳導的主要神經遞質，由軸突末梢釋放后穿過突觸間隙引起受體產生動作電位，AChE可將其水解為膽堿和乙酸，終止突觸傳遞，保證生物體神經信號的正常傳導[29]。AChE易受不良環境影響，Jebali等研究殺蟲劑、久效磷對鯽魚、羅非魚體內AChE活性的結果表明AChE可靈敏反映生物體對環境脅迫的響應[30，31]，Seok用硫丹處理泥鰍后，檢測其各項生理指標也表明AChE是良好的指示酶類[32]。本實驗中HHl.MH63組泥鰍的腦AChE活性均略高于空白組，且MH63組腦AChE活性隨稻桿粉濃度的增加而降低，說明泥鰍神經末梢對懸浮稻桿粉及水體環境改變的刺激反應敏銳，可引起神經興奮促進腦部AChE釋放。

肝臟的主要功能是解毒與代謝，當遭受不良脅迫時，即表現出靈敏的應激性與防御性。實驗中泥鰍肝臟AchE活性均隨稻桿粉濃度增加而下降，表明稻桿粉對肝臟AChE活性呈抑制效應，與稻桿粉濃度呈劑量一效應關系。此外，實驗檢測的AChE活性大小在泥鰍體內表現為：腦>肌肉>肝臟，證明了腦是中樞神經系統的主要部分，其調節和控制機體適應外界變化的靈敏度高于軀體神經和內臟神經，這與Reddy研究鯉魚不同組織AChE活性的結果一致[33]。

本研究表明轉融合基因CrylAb/Ac水稻HH1對泥鰍的蛋白水解酶和乙酰膽堿酯酶沒有明顯影響，而高劑量的轉基因水稻或非轉基因水稻稻桿粉均會影響泥鰍的消化能力與神經調節功能。本實驗只對飼養100d后的泥鰍進行了酶活性檢測，未能反映酶活性變化動態，研究也是在嚴格控制實驗條件下進行的，但轉Bt抗蟲水稻大田種植及稻桿還田后是否對泥鰍有影響，有待進一步開展相關的連續性動態實驗，以期全面了解轉Bt水稻對水生動物的影響。

致謝：華中農業大學林擁軍教授為本項目提供稻種，特此感謝！參考文獻（References）：

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