輔助性T細胞17在免疫相關性全血細胞減少癥中的免疫調節功能研究

董婷 李正發 歐陽紅梅 張芹 朱紅艷 蔣雅先 辜學忠 沈曉梅 楊同華 賴洵 史克倩 楊艷梅 聞艷 陸智祥

摘要：免疫相關性全血細胞減少（immune-related pancytopenia，IRP）是臨床多個學科易見的疾病，也是困擾臨床醫師的一大難題。近年來關于輔助性T細胞17 （T helper 17，Th17）對IRP發病作用的研究更是熱點。通過檢測免疫相關性全血細胞減少癥患者骨髓中Th17細胞數量及功能變化，探討Th17細胞在IRP中的免疫調節作用。研究發現，IRP患者（IL-23R）+CD4+/CD4+細胞比率及其骨髓上清液IL-6、IL-17、IL-23水平增高，提示IL-23介導的Th17細胞分化亢進可能是IRP發病原因之一。免疫干預治療可以顯著降低Th17細胞比率及IL-23R，抑制Th17細胞分化亢進可能是治療IRP的一個靶點。

關鍵詞：全血細胞減少；免疫相關；流式細胞術；（IL-23R）+CD4+/CD4+細胞；Th17細胞；IL-6；IL-17；IL-23

中圖分類號：R446.11

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0232-04

免疫相關性全血細胞減少癥（immunorelatedpancytopenia，IRP）是由于B淋巴細胞功能亢進、產生抗骨髓造血細胞自身抗體引起骨髓造血衰竭的自身免疫性血細胞減少性疾病。其與再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、陣發性血紅蛋白尿、慢性病性貧血等骨髓衰竭性疾病不易區分，容易混淆，危害性大，治療難以著手，是困擾臨床醫師的一大難題。輔助性T細胞17（T helper 17，Th17）是近年來研究發現的一種不同于T輔助細胞l和T輔助細胞2型的CD4+效應T細胞，具有獨立分化和發育調節機制，在自身免疫性疾病中具有重要意義[1]。有學者提出IRP患者中B淋巴細胞功能亢進、產生自身抗體可能與Th17細胞數量增多和功能亢進有關[2]。隨著研究的深入，已獲知IL-23R只表達在成熟的Th17細胞表面，是TH17細胞的一個標志性分子。因此，本文通過檢測IRP患者骨髓（IL-23R）+CD4+/CD4+細胞比率及上清液中IL-6、IL-17和IL-23水平，觀測其免疫干預治療前后的變化。力圖探明IRP區別于其他骨髓衰竭性疾病的本質以及Th17細胞在IRP中免疫調節作用，尋求可能成為IRP治療的新靶點。

1材料和方法

1.1病例

27例患者均取自于云南省第一人民醫院血液科初治住院病人，其中男14例，女13例，年齡13～60歲。其中16例明確診斷組經常規檢查已排除已知的各種血液系統疾病，且按文獻[2]標準擬診斷為IRP。另11例為造血衰竭疾病組，分別診斷為骨髓增生異常綜合征4例、再生障礙性貧血3例、陣發性睡眠性血紅蛋白尿4例，均符合國內診斷標準[3]。復診組12例為IRP經免疫干預治療后血常規恢復正?；颊?，達到完全緩解組（CR組）。正常對照組22例，其中男11例，女11例，年齡6～18歲。

1.2實驗分組

27例患者分別為A組（確診IRP組）、B組（造血衰竭疾病組）及C組（免疫干預治療后達完傘緩解組（CR組））另設正常對照組（22名正常人）。A組16例按文獻[2]確診為IRP患者。B組11例（其中骨髓增生異常綜合征4例、再生障礙性貧血3例、陣發性睡眠性血紅蛋白尿4例）。C組12例。采用流式細胞術（FCM）檢測A、B、C組及正常對照組骨髓白細胞介素（IL）-23受體（JL-23R）+CD4+/CD4+細胞比率。酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測A、B及正常對照組骨髓卜清液IL-6、IL-17、IL-23水平。

1.3試劑與儀器

異硫氰酸熒光素（FlrC）標記的鼠抗人CD3單克隆抗體，藻紅蛋白（PE）標記的鼠抗人CD4單克隆抗體以及它們各自的同型對照均購自于美國Beckman Coulter公司，純化的人類IgG、PerCP標記的IL-23R以及其同型對照均購自R&D公司。流式細胞儀型號FC500 MPL為美國BeckmanCoulter公司產品。IL-6、IL-17、IL-23 ELISA檢測試劑盒均為Bio-Swamp品牌試劑盒。

1.4 FCM檢測骨髓11-23R+CD4+細胞占CD4+細胞比率

取兩支檢測管，分別加入新鮮肝素抗凝骨髓液100μL，加入適量PBS液于離心機內洗滌2次，棄上清液后加入封閉劑人類IgG 20μL，常溫孵育15min，一管中加入CD4-PE、CD3-FITC、IL-23R-PerCP各20μL，另一管加入CD4-PE、CD3-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，4℃避光孵育40min，取出均加入紅細胞裂解液，混勻后孵育10min，加入適量PBS液混勻。同型對照加入IgG1-PE、IgG2-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，其他均按同樣方法操作。處理好的樣品用流式細胞術測定IL-23R+CD4+細胞、CD4+細胞比率。每個樣本收集15000個細胞。

1.5ELISA法檢測骨髓上清IL-6、IL-17和IL-23水平

取骨髓于離心機內離心，分別收集上清液。細胞因子水平上清液按ELISA試劑盒說明書操作。

1.6統計學處理

對正態分布的數據變量以χ±s表示，應用SPSS19.0數據軟件進行t檢驗和相關性回歸分析。

2結果

2.1骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細胞比率

確診IRP組患者IL-23R+CD4+/CD4+細胞比率[3.22±1.67]明顯高于B組[1.51±1.06]和正常對照組[1.59±1.06]（P<0.05），同時IRP確診組患者IL-23R+CD4+/CD4+細胞比率[3.22±1.67]也明顯高于C組[1.72±0.83]。B組、C組及正常對照組相互間差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細胞檢測典型圖例見圖1。

2.2骨髓上清IL-6、IL-17、IL-23水平

IRP組骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明顯高于造血衰竭疾病組和正常對照組（P<0.05），而造血衰竭疾病組和正常對照組差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

3討論

免疫相關性全血細胞減少癥是當前醫學界熱門課題之一，它是在鑒別骨髓造血功能衰竭綜合征時發現的一類新型血細胞減少疾病。目前認為該類疾病是因為機體產生了抗骨髓未成熟造血細胞自身抗體，進而導致一系、兩系或全血細胞減少。近年來，臨床采用腎上腺皮質激素、靜脈病種球蛋白、環磷酰胺、環孢素等免疫抑制劑取得了客觀的療效，有學者采用造血干細胞移植技術的探索也有進步，前景喜人。因而，探索IRP治療的新途徑、新靶點是有意義的工作[2，6]。

目前認為骨髓造血細胞自身抗體的產生是由于T淋巴細胞調控失衡所致。既往有學者發現此類患者Thl細胞與Th2細胞平衡明顯向Thl細胞降低傾斜，即Thl細胞途徑的抑制性負調控減低，Th2細胞途徑的刺激性正調控增強，細胞功能亢進，更有研究顯示免疫相關性全血細胞減少癥骨髓中Th2細胞高于Thl細胞3倍[4]，故體液免疫功能亢進。Th17細胞是一種不同于Thl和Th2型的第3類效應性T細胞，主要分泌IL-17、IL-17F及少量IL-6和TNF-a等細胞因子，其中IL-17是家族中最先發現的分子，也是Th17細胞發揮效應及介導疾病的核心因子。該細胞具有獨立分化和發育調節機制，在自身免疫性疾病中扮演著重要角色，研究顯示Th17細胞在類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等患者中均發現其數量增多、功能亢進[5]。可見，Th17細胞及其分泌的細胞因子參與多種自身免疫性疾病的發生和發展。來自初始免疫細胞和調節細胞的TGF-β是促進初始CD4+細胞分化Th17細胞的始動因素，除TGF-β外，IL-6在協同TGF-β共同誘導Th17細胞分化方面也發揮關鍵作用，TGF-p只有在IL-6協同下才能誘導Th17細胞的分化[6，7]。研究發現TGF-β和IL-6可驅使原始T細胞分化為Th17細胞，但與之伴隨產生的IL-10的炎癥抑制效應在一定程度上降低了Th17細胞的致病潛力。IL-23作用于成熟Th17細胞表面的IL-23R，能夠維持和擴大Th17細胞的分化和功能，而IL-23介導的Th17細胞分化過程中不生成IL-10但增加IL-17的致病效應[8]。

本文采用流式細胞術檢測確診IRP患者組（A組）、造血衰竭疾病組（B組）、完全緩解組（C組）和正常對照組的骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細胞比率。經統計學分析表明，A組患者IL-23R+CD4+/CD4+比率明顯高于B組患者及正常對照組，后兩組無顯著性差異。A組陽性患者IL-23R+CD4+/CD4+比率也明顯高于C組。說明IRP患者中Th17細胞數量增多、功能活躍，可能與IRP患者的免疫功能相關，此結果與既往研究相符[1]。其造血衰竭疾病患者（PNH、AA、MDS）Th17細胞比率趨于正常，據此我們可以將免疫相關性全血細胞減少癥與其他全血細胞減少加以區分。Th17細胞作為促炎細胞，能誘導免疫性疾病的發生，而Treg的功能卻和它截然相反。研究證實：Th17細胞和Treg在各自的分化生成、轉錄水平上均存在著相互制約關系，然而在特定的細胞因子環境中，Treg可以轉化成Th17細胞[9，10]。

酶聯免疫法實驗顯示：A組患者骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明顯高于B組和正常對照組。說明IRP患者骨髓上清液IL-6、IL-17、1L-23水平增高，提示IL-23介導的Th17細胞分化亢進可能是IRP發病原因之一。免疫干預治療可以顯著降低Th17細胞比率及IL-23R，抑制Th17細胞分化亢進可能是治療IRP的一個靶點。

綜上所述，本文推測Th17細胞在IRP患者中的免疫調節機理可能是：IRP患者體內IL-6水平增加，其協同TGF-β誘導Th17細胞的分化，同時IL-23作用于成熟的Th17細胞，進一步維持和擴大Th17細胞的分化和功能，引起Th17細胞數量增多、功能亢進，進而其分泌的細胞因子IL-17增多，1L-17激活細胞表面對應受體（IL-17R），導致趨化因子、集落刺激因子和粘附分子的表達或釋放，招募炎癥細胞如中性粒細胞，進而引起細胞侵潤和組織破壞，影響感染、腫瘤和自身免疫的病理過程。結合Th17細胞的生物學作用分析，IRP患者骨髓造血細胞自身抗體的產生可能與Th17細胞數量增多和功能亢進存在一定相關性，但深入的相關機制有待于進一步研究。

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