水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表達(dá)及純化

劉學(xué)群等

摘要 [目的]獲得外源表達(dá)的可溶性水稻VDAC3蛋白。[方法]將osvdac3基因克隆到含有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，并使用SDSPAGE和Western Blot檢測(cè)分析表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)Glutathione Resin 親和層析系統(tǒng)純化獲得較純的目的蛋白。[結(jié)果]試驗(yàn)成功構(gòu)建了pGEX4T1osvdac3原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過(guò)SDSPAGE和Western Blot試驗(yàn)證實(shí)56 kD處的蛋白條帶是具有可溶性表達(dá)的VDAC3蛋白。[結(jié)論]經(jīng)Glutathione Resin親和層析系統(tǒng)純化得到可溶性帶GST標(biāo)簽的VDAC3蛋白。該研究結(jié)果為水稻VDAC蛋白的功能研究進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 原核表達(dá)；GST標(biāo)簽；親和純化

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）13-03815-04

Abstract [Objective] To achieve activated OsVDAC3 protein in vitro.[Method] The recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 with the GSTtag was constructed and transformed into E.coli.TheGsttagged OsVDAC3 protein was induced with IPTG in E.coli strain BL21， and confirmed by SDSPAGE and WesternBlot analysis.In addition， the GSTtagged recombinant OsVDAC3 protein was purified by Glutathione resin.[Result] The results showed that the recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 was constructed and transformed into E.coli successfully.The results of SDSPAGE and Western Blot showed a band in the 56 kD and indicated the GSTtag OSVDAC3 protein was partly existed in the soluble composition.[Conclusion] The GSTtag OsVDAC3 protein was isolated and purified by using Glutathione Resin.The research laid a foundation for the further study of the function of VDAC in the rice.

Key words Prokaryotic expression； GST tag； Affinity purification

電壓依賴性陰離子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）是線粒體外膜高度的保守的，最豐富的蛋白，在所有的真核生物中都存在。在調(diào)節(jié)代謝物在線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸具有重要的作用[1-2]。在植物中，煙草中至少有3種亞型，擬南芥和百脈根中發(fā)現(xiàn)有5種不同的亞型。較酵母與哺乳動(dòng)物，植物中有更多的VDAC異構(gòu)形式，暗示植物VDAC具有多種不同的功能[3-6]。實(shí)驗(yàn)室前期工作證明，水稻基因組中存在8個(gè)vdac基因，不同vdac基因在水稻不同組織和生殖發(fā)育時(shí)期的表達(dá)不同，同時(shí)vdac基因的表達(dá)受各種生物和非生物的脅迫的影響，如鹽脅迫和熱脅迫等[7-8]。這些結(jié)論都表明，不同的VDAC蛋白對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。羅鳳燕等通過(guò)Real-time PCR比較分析了8個(gè)vdac基因在紅蓮型水稻不育系YTA不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)osvdac3在水稻生殖生長(zhǎng)期達(dá)到較高表達(dá)水平，顯示其可能參與水稻的生殖發(fā)育相關(guān)過(guò)程[8]。江晨等利用Gateway重組克隆技術(shù)對(duì)水稻YTB中的osvdac3基因進(jìn)行基因干涉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)率明顯低于野生型YTB[9]。

在原核細(xì)胞表達(dá)外源基因過(guò)程中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，形成包涵體（ inclusion body）。以包涵體形式存在的蛋白質(zhì)分子不具有正確的天然三維結(jié)構(gòu)， 表達(dá)蛋白不具有生物活性[10-11]，為后續(xù)的研究提供了諸多的不便。VDAC蛋白作為跨膜蛋白，在原核表達(dá)時(shí)大多以包涵體的形式存在。雖然可以通過(guò)蛋白變性等方法可以獲得可溶性蛋白，但這樣得到的可溶性蛋白常常會(huì)帶來(lái)蛋白結(jié)構(gòu)上的改變，不利于后期的進(jìn)一步功能研究[12]。因此，試驗(yàn)以前期得到的與水稻生殖發(fā)育相關(guān)的osvdac3基因?yàn)閷?duì)象，構(gòu)建pGEX4T1osvdac3原核表達(dá)載體并嘗試不同的IPTG誘導(dǎo)條件，純化得到可溶性GSTOsVDAC3融合蛋白，以期為下一步獲取與OsVDAC3蛋白相互作用的水稻蛋白及研究該蛋白在水稻生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器。752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精科公司；Gene Genius系統(tǒng)，購(gòu)自SYNOPTICS LTD（英國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；C1000 touch thermal cyclerPCR儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司；CR22G高速離心機(jī)，購(gòu)自日本Hitachi公司；FB-SDB-2020半干式轉(zhuǎn)印槽，購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；Model 1000分子雜交箱，購(gòu)自美國(guó)Robbins Scientific Corporation；Soniprep 150超聲破碎儀，購(gòu)自日本SANYO公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑。限制性內(nèi)切酶BamHI、XholI，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)rTaq酶，蛋白分子量Marker和DNA分子量Marker，T4 DNA連接酶，皆購(gòu)自于Takara公司；PagerulerPrestained蛋白分子量Marker，購(gòu)自FERMENTAS公司。DNA凝膠回收及清潔試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；GST抗體及二抗，均購(gòu)自南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司；引物及測(cè)序均有南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行。

1.2 方法

3 結(jié)論與討論

關(guān)于VDAC，以前人們更多的是集中在動(dòng)物中VDAC功能的研究。隨著研究的深入，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注植物中的VDAC，并發(fā)現(xiàn)植物的VDAC蛋白在植物的生長(zhǎng)與發(fā)育起到了十分重要的作用。Liu等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，VDAC3與AtKP1相互作用能夠調(diào)節(jié)種子在低溫萌發(fā)是的呼吸作用，Himmelbach， Yang等發(fā)現(xiàn)，VDAC與AtGluRS相互作用在ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到了重要的調(diào)節(jié)作用[13]。因此針對(duì)VDAC相互作用蛋白的研究對(duì)明確VDAC蛋白的功能是有非常重要的。同時(shí)，體外pulldown試驗(yàn)通常需要可溶性的VDAC蛋白，但在VDAC蛋白的的研究中，外源表達(dá)VDAC蛋白時(shí)常會(huì)形成包涵體，因此需要通過(guò)復(fù)性操作以得到具有預(yù)期生物活性的蛋白質(zhì)。而通常的包涵體復(fù)性過(guò)程中，復(fù)性條件難以控制，成本高，在復(fù)性過(guò)程中也很難保證包涵體蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)。而如果能從上清較少的表達(dá)量中純化出可溶性的VDAC蛋白，則會(huì)避免這個(gè)問(wèn)題。

實(shí)驗(yàn)室前期采用pET30a（+）原核表達(dá)載體，構(gòu)建了帶有組氨酸標(biāo)簽的OsVDAC3融合蛋白的原核表達(dá)載體[14]。但是帶有組氨酸標(biāo)簽的OsVDAC3融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，幾乎不能純化出可溶性的帶有組氨酸標(biāo)簽的OsVDAC3融合蛋白。因此試驗(yàn)采用pGEX4T1原核表達(dá)載體，其在目標(biāo)蛋白的N端加上一個(gè)約26 kD的GST標(biāo)簽蛋白，在原核表達(dá)時(shí)得到了較pET30a（+）原核表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)更多的可溶型VDAC3蛋白，說(shuō)明GST標(biāo)簽可能具有增進(jìn)原核表達(dá)蛋白可溶型的作用；也為進(jìn)一步去研究OsVDAC3蛋白在水稻中的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] ABRECHT H，GOORMAGHTIGH E，RUYSSCHAERT J M，et al.Structure and orientation of two voltagedependent anionselective channel isoforms[J].Journal of Biological Chemistry，2000，275（52）： 4099240999.

[2] MLAYEH L，CHATKAEW S，LONETTI M，et al.Modulation of plant mitochondrial VDAC byphytosterols[J].Biophys Journal，2010，99（7）：2097-2106.

[3] ELKELES A，DEVOS K M，GRAUR D，et al.Multiple cDNAs of wheat voltage-dependent anion channels （VDAC）：Isolation，differential expression，mapping and evolution[J].Plant Molecular Biology，1995，29： 109-124.

[4] ALBITAR F， ROOSENS N， SMEYERS M，et al.Sequence analysistranscriptional and posttranscriptional regulation of the rice vdac family，Biochim，Biophys[J].Acta， Gene Struct Expression，2003，1625：43-51.

[5] WANDREY M，TREYASKIS B，BREWIN N，et al.Molecular and cell biology of a family of voltage- dependent anion channel porins in Lotus japonicus[J].Plant Physiol，2004，134：182-193.

[6] SMACK D P，COLOMBINI M.Voltagedependent channels found in the membrane fraction of corn mitochondria[J].Plant Physiol，1985，79：1094-1097.

[7] 羅鳳燕.水稻vdac、ant及HL-sp1基因的表達(dá)研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2010.

[8] 夏春皎.水稻線粒體滲透性轉(zhuǎn)換的鑒定及其相關(guān)基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析[D].武漢：中南民族大學(xué)，2010.

[9] 江晨，程鋼，劉學(xué)群，等.水稻osvdac基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（28）：17176-17178.

[10] 包義風(fēng)，應(yīng)蓮芳，蔣琳.包涵體蛋白復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012（2）：84-88.

[11] 張婷婷，葉波平.包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2007（4）：306-309.

[12] 趙喜紅，何小維，李文美，等.大腸桿菌表達(dá)包涵體蛋白體外復(fù)性研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2010（6）：379-383.

[13] TATEDA C，WATANABE K.KUSANO T，et al.Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2011，62： 4773-4785.

[14] 秦圣光.兩個(gè)osvdac基因的原核表達(dá)及其對(duì)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化[D].武漢：中南民族大學(xué)，2011.