嵌合型口蹄疫病毒樣顆粒組裝研究

敖大等

摘要 [目的]為研究和制備多聯或多價口蹄疫病毒樣顆粒疫苗奠定基礎。[方法]將FLAG序列通過融合PCR技術插入口蹄疫結構蛋白VP1GHloop可變區，并通過大腸桿菌原核表達技術表達口蹄疫病毒衣殼蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1，在體外組裝出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒樣顆粒。[結果]大腸桿菌表達的口蹄疫衣殼蛋白主要以可溶性存在，在緩沖體系中融合標簽被切除衣殼蛋白VP0、VP3和FLAGVP1組裝成病毒樣顆粒，其大小約25 nm左右。FLAG序列成功插入GHloop可變區第150-151氨基酸位點之間，外源多肽的插入沒有影響衣殼蛋白VP1的空間結構。[結論]口蹄疫loop可變區引入外源抗原是可行的，但外源多肽的大小及理化性質會影響病毒樣顆粒的組裝效率。

關鍵詞 口蹄疫病毒；原核表達；GHloop；嵌合型病毒樣顆粒

中圖分類號 S855.99 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03902-05

Abstract [Objective] The research aimed to lay the foundation for studying and preparing multiple or polyvalent viruslike particle vaccine of foot and mouth disease virus. [Method] FLAG sequence was inserted into variable region of structural protein VP1 GHloop of foot and mouth disease virus. Capsid proteins VP0， VP3 and chimeric VP1 of foot and mouth disease virus were expressed in Escherichia coli prokaryotic expression system. And the viruslike particles of foot and mouth disease virus with FLAG exogenous polypeptide was assembled in vitro. [Result] The capsid proteins of foot and mouth disease virus expressed by E. coli were mainly dissoluble. The fusion protein was cut in the buffer system， and capsid proteins VP0， VP3 and FLAG VP1 were assembled into viruslike particle （the size of about 25 nm）. FLAG sequence was successfully inserted into 150-151 amino acid sites of variable region of GHloop. The insertion of exogenous polypeptide didnt influence the spatial structure of capsid protein VP1. [Conclusion] It was feasible to insert exogenous antigen into variable region of GHloop， but the size and physical and chemical characteristics of exogenous polypeptide would influence the assembly efficiency of viruslike particle.

Key words Foot and mouth disease； Prokaryotic expression； GHloop； Chimeric viruslike particles

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其易感動物主要是牛、羊等偶蹄動物。口蹄疫在亞洲、非洲和中東以及南美洲均有發生，造成了巨大的經濟損失，被世界衛生組織劃分為A類疾病[1-2]。目前，預防控制該病的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗，但全病毒疫苗存在散毒風險且在交叉免疫保護方面存在不足。由于口蹄疫病毒有7個血清型、65個亞型[3]，在特定的口蹄疫感染區域常伴有多種抗原變異體共同流行，因此迫切需要研發新型、高效的多價口蹄疫疫苗。

對口蹄疫病毒結構蛋白的研究發現，其衣殼蛋白GHloop突出于病毒衣殼表面[4]，包含口蹄疫病毒的主要抗原表位[5-8]，且后續研究表明loop環抗原表位合成肽能夠與相關抗體相互作用[9]。研究表明，loop環中保守的ArgGlyAsp（RGD）序列是細胞整合素識別位點，RGD序列與口蹄疫病毒侵入細胞密切相關[10-12]，且RGD序列兩側的殘基高度可變。因此，研究人員在重組亞洲I型口蹄疫病毒GHloop環中的150～151氨基酸之間插入含有10個氨基酸的保守序列（RTSRRGDAAA）成功完成病毒拯救。將FLAG外源多肽嵌入口蹄疫衣殼蛋白GHloop環RGD基序上游，成功構建了FLAG標記的重組口蹄疫病毒[13]。O型口蹄疫病毒中和表位插入亞洲I型口蹄疫GHloop可變區成功構建出多表位重組口蹄疫病毒，誘導機體能產生抗2種血清型的中和抗體[14]。以上研究均證實口蹄疫病毒GHloop可變區耐受外源多肽的插入。

病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs）作為最接近自然病毒粒子但不含病毒基因的類病毒顆粒在多個研究領域的突破性進展盡顯其顯著優勢，尤其在疫苗研究及應用領域。VLPs重復且有序排列的抗原表位能夠誘導近乎病毒自然感染的免疫力，被認為是目前最具優勢的候選疫苗。目前有多種病毒都進行了病毒樣顆粒疫苗的研究，如口蹄疫病毒[15-17]、豬圓環病毒[18-19]、人免疫缺陷性病毒[20]、乳頭瘤病毒[21-23]等，病毒樣顆粒疫苗的免疫效果與全病毒疫苗（滅活苗或弱毒苗）接近，但在交叉免疫方面仍然存在缺陷。因此，研究人員在病毒樣顆粒疫苗研究的基礎上進一步開始研究多價或多聯病毒樣顆粒疫苗，如嵌合型細小病毒樣顆粒疫苗[24-25]、乳頭瘤病毒多聯病毒樣顆粒疫苗[26-28]。

基于口蹄疫病毒樣顆粒體外組裝的研究及口蹄疫病毒GHloop獨特的特點，筆者將FLAG標簽蛋白插入衣殼蛋白GHloop環，通過大腸桿菌原核表達技術表達口蹄疫病毒衣殼蛋白并體外組裝出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒樣顆粒。筆者首次體外組裝嵌合型口蹄疫病毒樣顆粒，以期為研究制備多聯或多價口蹄疫病毒樣顆粒疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種、表達載體及抗體

含南非2型FMDV分離株VP1、VP0和VP3編碼區的重組克隆質粒pUC57SAT2V1、pUC57SAT2V0及pUC57SAT2V3由家畜疾病病原生物學國家重點實驗室保存。帶有 SUMO 和 6×His 融合標簽的 pSMK、pSMA表達載體、JM109大腸桿菌及BL21（DE3）RIL表達菌株，均購自生工生物工程（上海）有限公司。小鼠抗 His 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗鼠IgG抗體、兔抗FLAG單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG抗體，均購自Sigma公司。

3 討論

大腸桿菌缺乏外源蛋白翻譯后修飾體系，因此通常情況下大腸桿菌表達的外源蛋白大多以包涵體的形式存在，包涵體純化需要變性、復性對衣殼蛋白的空間結構損傷較大，不利于體外包裝病毒樣顆粒。筆者對衣殼蛋白進行小泛素化修飾增加了目的蛋白的水溶性，實現了大腸桿菌可溶性表達口蹄疫衣殼蛋白，不僅為體外組裝病毒樣顆粒提供充足的蛋白，還保證了衣殼蛋白的空間構象不被破壞。尤其小泛素化修飾蛋白酶特異性識別小泛素化修飾蛋白可以通過小泛素化修飾蛋白酶將小泛素化修飾蛋白與目的蛋白分離使目的蛋白以天然構象存在，避免了小泛素化修飾蛋白對衣殼蛋白組裝的影響。

口蹄疫病毒結構蛋白VP1 GHloop環包含口蹄疫病毒主要抗原表位，能夠誘導機體產生保護性中和抗體反應，其結構研究表明loop環突出于病毒衣殼表面且RGD基序周圍是高度可變區，這為可變區內插入外源表位提供了理論依據。目前，通過細小病毒VP1獨特區及乳頭瘤病毒loop區插入外源表位成功制備出高免疫力嵌合型病毒樣顆粒疫苗，這為制備嵌合型口蹄疫病毒樣顆粒奠定了實踐基礎。亞洲1型口蹄疫病毒免疫表位插入O型口蹄疫病毒GHloop可變區既不影響O型口蹄疫病毒的復制，同時制備的重組病毒能夠被特定的抗O型和亞洲1型特定表位的抗體識別，說明GHloop可變區免疫表位的插入沒有破壞O型口蹄疫病毒loop可變區的免疫表位，且將亞洲1型口蹄疫病毒特定免疫表位呈遞到病毒衣殼表面。目前研究表明二十面體病毒樣顆粒在組裝過程中跟真實病毒組裝相似，組裝過程中都會由衣殼蛋白組裝成單體，再由單體通過共價鍵或疏水作用有序聚集形成組裝前體或病毒樣顆粒，因此推測GHloop環可變區插入外源多肽不會影響口蹄疫病毒衣殼蛋白的組裝，能夠形成嵌合型病毒樣顆粒。該試驗表明loop可變區150～151氨基酸位點FLAG標簽蛋白的插入沒有影響蛋白空間構象，并成功組裝出嵌合型口蹄疫病毒樣顆粒。這表明口蹄疫loop可變區引入外源抗原是可行的，但外源多肽的大小及理化性質會影響病毒樣顆粒的組裝效率。對于外源多肽的插入是否會影響或破壞口蹄疫病毒本身的抗原表位，有待進一步研究。

參考文獻

[1] DOMINGO E，BARANOWSKI E，ESCARMIS C，et al.Footandmouth disease virus[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2002，25：297-308.

[2] MASON P W，GRUBMAN M J，BAXT B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J].Virus Res，2003，91：9-32.

[3] PEREIRA H G.Subtyping of footandmouth disease virus[J].Dev Biol Stand，1976，35：167-174.

[4] ACHARYA R，FRY E，STUART D，et al.The threedimensional structure of footandmouth disease virus at 2.9 A resolution[J].Nature，1989，337：709-716.

[5] LOGAN D，ABUGHAZALEH R，BLAKEMORE W，et al.Structure of a major immunogenic site on footandmouth disease virus[J].Nature，1993，362：566-568.

[6] MATEU M G，MARTINEZ M A，ROCHA E，et al.Implications of a quasispecies genome structure：effect of frequent，naturally occurring amino acid substitutions on the antigenicity of footandmouth disease virus[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：5883-5887.

[7] PFAFF E，MUSSGAY M，BOHM H O，et al.Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus[J].EMBO J，1982，1：869-874.

[8] STROHMAIER K，FRANZE R，ADAM K H.Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein[J].J Gen Virol，1982，59：295-306.

[9] BITTLE J L，HOUGHTEN R A，ALEXANDER H，et al.Protection against footandmouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence[J].Nature，1982，298：30-33.

[10] BURMAN A，CLARK S，ABRESCIA N G，et al.Specificity of the VP1 GH loop of FootandMouth Disease virus for alphav integrins[J].J Virol，2006，80：9798-9810.

[11] JACKSON T，ELLARD F M，GHAZALEH R A，et al.Efficient infection of cells in culture by type O footandmouth disease virus requires binding to cell surface heparan sulfate[J].J Virol，1996，70：5282-5287.

[12] MATEU M G，VALERO M L，ANDREU D，et al.Systematic replacement of amino acid residues within an ArgGlyAspcontaining loop of footandmouth disease virus and effect on cell recognition[J].J Biol Chem，1996，271：12814-12819.

[13] LAWRENCE P，PACHECO J M，UDDOWLA S，et al.Footandmouth disease virus（FMDV）with a stable FLAG epitope in the VP1 GH loop as a new tool for studying FMDV pathogenesis[J].Virology，2013，436：150-161.

[14] WANG H，XUE M，YANG D，et al.Insertion of type Oconserved neutralizing epitope into the footandmouth disease virus type Asia1 VP1 GH loop：effect on viral replication and neutralization phenotype[J].J Gen Virol，2012，93：1442-1448.

[15] GOODWIN S，TUTHILL T J，ARIAS A，et al.Footandmouth disease virus assembly：processing of recombinant capsid precursor by exogenous protease induces selfassembly of pentamers in vitro in a myristoylationdependent manner[J].J Virol，2009，83：11275-11282.

[16] GUO H C，SUN S Q，JIN Y，et al.Footandmouth disease viruslike particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs，swine and cattle[J].Vet Res，2013，44：48.

[17] LEE C D，YAN Y P，LIANG S M，et al.Production of FMDV viruslike particles by a SUMO fusion protein approach in Escherichia coli[J].J Biomed Sci，2009，16：69.

[18] WU P C，LIN W L，WU C M，et al.Characterization of porcine circovirus type 2 （PCV2）capsid particle assembly and its application to viruslike particle vaccine development[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，95：1501-1507.

[19] YIN S，SUN S，YANG S，et al.Selfassembly of viruslike particles of porcine circovirus type 2 capsid protein expressed from Escherichia coli[J].Virol J，2010，7：166.

[20] CAMPBELL S，FISHER R J，TOWLER E M，et al.Modulation of HIVlike particle assembly in vitro by inositol phosphates[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：10875-10879.

[21] XIE M，LI S，SHEN W，et al.[Expression，purification and immunogenicity analysis of HPV type 18 viruslike particles from Escherichia coli[J].Chinese Journal of Biotechnology，2009，25：1082-1087.

[22] YAN C，LI S，WANG J，et al.[Expression，purification and immunogenicity of human papillomavirus type 11 viruslike particles from Escherichia coli[J].Acta microbiologica Sinica，2009，49：1527-1533.

[23] ZHANG W，CARMICHAEL J，FERGUSON J，et al.Expression of human papillomavirus type 16 L1 protein in Escherichia coli：denaturation，renaturation，and selfassembly of viruslike particles in vitro[J].Virology，1998，243：423-431.

[24] CASAL J I，RUEDA P，HURTADO A.Parvoviruslike particles as vaccine vectors[J].Methods，1999，19：174-186.

[25] RUEDA P，HURTADO A，DEL BARRIO M，et al.Minor displacements in the insertion site provoke major differences in the induction of antibody responses by chimeric parvoviruslike particles[J].Virology，1999，263：89-99.

[26] MULLER M，ZHOU J，REED T D，et al.Chimeric papillomaviruslike particles[J].Virology，1997，234：93-111.

[27] SLUPETZKY K，SHAFTIKERAMAT S，LENZ P，et al.Chimeric papillomaviruslike particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol，2001，82：2799-2804.

[28] XU Y F，ZHANG Y Q，XU X M，et al.Papillomavirus viruslike particles as vehicles for the delivery of epitopes or genes[J].Arch Virol，2006，151：2133-2148.