調控橡膠樹法尼基焦磷酸合酶基因轉錄因子的初步篩選

郭冬 李輝亮 楊子平 彭世清

摘 要 為研究橡膠樹中法尼基焦磷酸合酶基因（HbFPS）的表達調控機制，采用酵母單雜交技術篩選了膠乳中與HbFPS啟動子結合的蛋白因子。將HbFPS啟動子與報告質粒pHIS2.1連接構建誘餌質粒pHis-FPS，經篩選確定抑制背景表達的3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）濃度為10 mmol/L。同時以橡膠樹膠乳mRNA為模板合成雙鏈cDNA，并將雙鏈cDNA、線性化的pGADT7Rec2載體和誘餌質粒pHis-FPS共同轉化酵母菌株Y187，兩載體共轉化效率為1.7×106 cfu/μg。篩選共得到陽性克隆36個，獲得31條序列。對獲得的cDNA序列進行生物信息學分析，得到2個轉錄因子序列，分別為類乙烯響應轉錄因子ERF003和HbLMYC2。結果為進一步研究HbFPS表達調控機制奠定基礎。

關鍵詞 橡膠樹；法尼基焦磷酸合酶；轉錄因子

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPS）是植物類異戊二烯合成途徑中的一個重要關鍵酶，催化2分子的異戊烯基焦磷酸和1分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4頭尾連續縮合反應，形成15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）[1]。FPP是植物體內甾醇、三萜、長醇、泛醌、類胡蘿卜素、橡膠等許多萜類衍生物質的合成前體[2]。目前在植物中關于FPS的研究主要集中在基因克隆、表達特性分析和過量表達對次生代謝產物的影響[3-6]。研究結果表明，FPS的過量表達會提高次級代謝產物的產量[7-8]，在青蒿（Artemisia annua）中過量表達AaFPS，轉基因植株中青篙素的含量比對照組高30%左右[9]；Chen等[10]將棉花的FPS在青篙中過量表達，轉基因發根系中青篙素含量約為對照組的3～4倍，轉基因植株中青篙素的含量比對照組高2～3倍；在積雪草（Centella asiatica）過量表達來自人參的FPS，轉基因植株中植物甾醇和三萜烯含量有明顯的提高[4]。而對FPS轉錄水平上調控因子的研究尚未見報道。

天然橡膠的生物合成是一種典型的植物類異戊二烯的次生代謝途徑。同位示蹤術和核磁共振成像技術的研究結果表明，FPP是橡膠生物合成的起始物[11]。橡膠生物合成的速率與細胞內的FPP濃度呈正相關，FPP濃度越高，橡膠合成的速率越大[12]。由于HbFPS是天然橡膠生物合成途徑中的一個重要關鍵酶，因此，研究HbFPS的表達調控機制對促進天然橡膠生物合成有重要意義。尋找與HbFPS調控序列中順式作用元件特異結合蛋白，是進一步研究HbFPS表達調控機制的關鍵。酵母單雜交系統是目前廣泛應用于克隆和鑒定動植物轉錄因子的有效方法。本研究在分離HbFPS 5′調控序列的基礎上[13]，通過酵母單雜交技術篩選得到與其結合的蛋白，以期為獲得調控HbFPS表達的轉錄因子并研究其調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）7-33-97種植于中國熱帶農業科學院試驗農場。采集幼葉進行橡膠樹基因組DNA提取。膠乳采樣按Tang等[14]的方法進行，再用液氮收集。

1.1.2 質粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。mRNA 分離和純化試劑盒polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit、IPTG、X-gal和dNTPs購于promega公司。酵母單雜交系統MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit購自Clontech 公司。E.coli DH5α由本實驗室保存。DNA合成和測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HbFPS啟動子誘餌載體的構建與鑒定 根據pHIS2.1多克隆位點信息，對前期報道的HbFPS啟動子序列[13]進行酶切位點分析，設計一對特異上游和下游引物，并分別引入MluⅠ和SpeⅠ酶切位點，引物序列為pFPSF：5′-CCGACGCGTCTGCAT

TTTTATGATTAA-3′和pFPSR：5′-GCGACTAGTGG

ATTCAAACGGAGATTAG-3′。以橡膠樹基因組DNA為模板進行PCR反應。反應體系：在0.2 mL的離心管中加入1 μL DNA、10×PCR反應緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 5 min。將純化的PCR產物克隆至pMD19T simple Vector，轉至DH5α，抽提質粒，測序鑒定，獲得重組質粒pMD19-FPS。將pMD19-FPS用MluⅠ和SpeⅠ進行雙酶切并回收目標片段，連接到經相同酶切的pHIS2.1載體上，連接產物轉化至DH5α，抽提質粒用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定，獲得HbFPS啟動子誘餌載體pHis-FPS。

1.2.2 酵母單雜交誘餌載體背景表達抑制劑濃度的篩選 按照MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit的操作說明，使用醋酸鋰轉化法，將誘餌載體pHis-FPS轉化到酵母菌株Y187中，將轉化液涂布于含不同濃度（0、5、10、20、30、40、60、80、100 mmol/L）3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）的酵母營養缺陷性培養基SD/-His/-Trp選擇培養平板上，30 ℃培養5～10 d后，觀察酵母生長情況。

1.2.3 膠乳總RNA的提取和雙鏈cDNA的合成

橡膠膠乳總RNA的提取參照Tang等[14]的提取方法進行。按照polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit的操作說明分離純化mRNA。應用MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit對所獲得mRNA進行反轉錄，得到末端含SMARTTM Ⅲ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA。將獲得的雙鏈cDNA經CHROMA SPINTM TE-400樹脂層析柱（Clontech公司）純化后備用。

1.2.4 cDNA文庫質粒轉化酵母細胞 按照MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit的操作要求，將5 μg誘餌載體質粒pHis-FPS、20 μL雙鏈cDNA和3 μg經SmaⅠ線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2，用LiAc/PEG法共轉化至酵母菌Y187感受態細胞中。將轉化后的酵母細胞用6 mL 0.9% NaCl溶液重新懸浮，再按1/10、1/100和1/1000的比例分別稀釋，從稀釋液里各取100 μL分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp平板上培養，用于計算轉化效率。剩余酵母細胞懸浮液按100 μL每皿涂布在營養缺失培養基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上篩選陽性克隆。平板放置30℃培養5～10 d后，觀察酵母生長情況。

1.2.5 酵母單雜交陽性克隆的篩選鑒定 根據pGADT7-Rec2載體中雙鏈cDNA插入區段兩側序列設計一對上下游引物S1：5′-TTCCACCCAAGCA

GTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′和S2：5′-GTATC

GATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′。選取營養缺陷培養平板上生長直徑大于1 mm的酵母菌落進行菌落PCR篩選，PCR反應體系：在0.2 mL的離心管中加入少量酵母菌落、10×PCR反應緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，共30個循環。取7 μL PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR鑒定的陽性克隆重新在營養缺失培養基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上劃線培養，連續分離3代，通過酵母菌落PCR的方法選擇出同時具有文庫載體和誘餌載體的克隆。

1.2.6 陽性克隆序列分析 將鑒定為陽性克隆的PCR產物克隆至pMD19T載體上，轉至DH5α，提取質粒，經PCR驗證后測序。將測序結果進行blastx比對分析，確定目的基因所編碼的靶蛋白及其生物學功能。

2 結果與分析

2.1 HbFPS啟動子誘餌載體的構建

以橡膠樹基因組DNA為模板，PCR擴增獲得長約1.1 kb的HbFPS啟動子目標片段（圖1）。PCR產物連接到pMD19T 載體后用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切質粒驗證，切下約1.1 kb片段，與目標帶型大小一致（圖2），陽性克隆測序結果與HbFPS啟動子序列完全相同，表明HbFPS啟動子誘餌載體構建成功，命名為pHis-FPS。

2.2 誘餌載體pHis-FPS背景表達抑制劑濃度的篩選

將誘餌載體pHis-FPS轉化到酵母菌株Y187中，在含有不同濃度3-AT的SD/-His/-Trp選擇培養平板培養3～5 d后，觀察發現3-AT濃度達到20 mmol/L及以上時，幾乎沒有克隆長出，10 mmol/L時有少量克隆長出，5 mmol/L時長出克隆較多。又將SD/-His/-Trp選擇培養平板中分別加入4、6、8、10 mmol/L的3-AT再次篩選，結果顯示3-AT濃度為10 mmol/L時仍然只有少量克隆長出（圖3），因此將10 mmol/L的3-AT濃度作為酵母單雜交誘餌載體背景表達抑制劑濃度。

2.3 酵母單雜交雙鏈cDNA的合成

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的橡膠樹膠乳總RNA，結果顯示，總RNA有2條清晰的條帶（圖4），條帶均無拖尾現象，表明總RNA的提取未發生降解。紫外分光光度計測量樣品OD260/OD280=1.97，濃度為10.13 mg/mL，表明總RNA純度較高。將總RNA分離純化得到mRNA，經反轉錄獲得末端含SMARTTMⅢ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA，并純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，純化后的雙鏈cDNA片段大小分布在300～2500 bp之間（圖5）。

2.4 酵母單雜交文庫的構建和初步篩選

將純化后的雙鏈cDNA、誘餌載體質粒pHis-FPS和線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2，共轉化至酵母菌Y187感受態細胞中，分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT的固體培養基中，培養5～10 d后發現，SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Trp/-Leu平板上均有較多克隆長出，表明誘餌載體質粒pHis-FPS和線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2同時轉入了酵母菌Y187細胞中。統計SD/-Trp/-Leu平板上共長出克隆284個，2種載體的共同轉化效率為1.7×106 cfu/μg。SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT平板共長出直徑大于1 mm的酵母菌落45個。

2.5 陽性克隆篩選和基因功能注釋

使用載體特異引物S1和S2對45個直徑大于1 mm的酵母菌落進行菌落PCR篩選，共36個克隆擴增出清晰條帶，均大于350 bp（空載體引物約300 bp）。其中擴增條帶大于1 kb的克隆有12個，大于750 bp的克隆14個，大于350 bp的克隆10個。圖6為部分酵母菌落PCR檢測結果。PCR擴增產物連接到T載體pMD19T上，篩選陽性克隆進行測序。共測序36條，除去因特殊結構未測出序列，共獲得31條可讀序列。

將獲得序列去除載體后，使用NCBI數據庫中的Blastx工具進行同源比對分析。去除匹配重復的蛋白序列后，篩選到的蛋白多為功能未知蛋白。經過多次篩選，得到2個轉錄因子序列可能與HbFPS啟動子序列結合：一個序列編號FPSYOH12，共分離cDNA序列623 bp，推導最大編碼171個氨基酸，其中2～40 aa預測為AP2/ERF類轉錄因子保守結構域，blastx比對結果顯示，該序列與葡萄中乙烯響應轉錄因子ERF003（登錄號：XP002285373）同源性為76%（圖7-a）；另一個序列編號FPSYOH26，共分離cDNA序列624 bp，推導最大編碼180個氨基酸，其中9～59 aa預測為bHLH類轉錄因子保守結構域，blastx比對結果顯示，該序列與橡膠樹HbLMYC2 cDNA序列（登錄號：HM061097）同源性高達為97%（圖7-b）[15]。

3 討論

轉錄因子作為一種DNA結合蛋白，通過與基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性相互作用，調節基因表達的強度或控制靶基因的時空特異性表達，應答激素刺激和外界環境的脅迫，在植物生長發育過程中起到重要的調控作用。酵母單雜交技術根據體內DNA結合蛋白與順式作用元件結合調控報告基因表達的原理，已成為分離轉錄因子的有效手段。本研究將HbFPS的啟動子區段構建到酵母單雜交誘餌載體pHIS2.1上，以期獲得能夠調控HbFPS基因的轉錄因子。結果顯示，筆者初步篩選得到乙烯響應轉錄因子ERF003和bHLH類轉錄因子HbLMYC2與HbFPS啟動子區段結合。ERF轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，是AP2/ERF類轉錄因子超級家族中的一個亞家族，ERF類轉錄因子基因受多種植物激素誘導，如乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等，干旱、鹽堿、低溫、病害、機械損傷等生物與非生物脅迫也會誘導其表達。ERF類轉錄因子參與植物體內多種信號轉導途徑，在植物體的抗逆性調控中發揮著不可替代的作用，同時在調控植物的生長發育中也發揮著作用[16]。MYC轉錄因子家族是bHLH超家族的一種，是植物激素（如茉莉酸、乙烯、脫落酸等）響應途徑中的核心轉錄因子，具有多種調節功能，并廣泛存在與動植物中[17]。MYC2是已發現植物MYC類轉錄因子中研究最為深入的一個，擬南芥MYC2轉錄因子通過形成COI1/JAZ/MYC2復合體發揮調控作用，參與茉莉酸、脫落酸等植物激素信號轉導過程[18]。最近研究結果表明，MYC2轉錄因子受赤霉素和茉莉酸信號的協同調控，直接激活擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11來調控倍半萜的合成和釋放，促進擬南芥花中倍半萜的合成[19]。通過對HbFPS啟動子序列的順式作用元件分析，該區段含有響應乙烯的順式作用元件ERELEE4（AWTTCAAA，-1027）和MYC的順式作用元件（CANNTG，-936）[20-21]，筆者推測所獲得轉錄因子與這些元件結合，從而響應上游轉導信號對HbFPS表達調控，但具體的結合元件和調控機理還有待進一步驗證和研究。

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責任編輯：趙軍明