多花水仙WRKY轉錄因子的克隆與序列分析

李歡 何炎森 李科 申艷紅 吳用 陳曉靜

摘 要 以‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺為材料，根據課題組已克隆出的多花水仙轉錄因子WRKY基因片段設計特異引物，通過RACE技術分別從2個水仙品種中克隆出2個不同的WRKY基因，命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b，開放閱讀框（ORF）長度分別為945和951個堿基。序列分析結果表明，兩序列均含有WRKYGQK保守結構域；‘黃花水仙2號與‘金盞銀臺、擬南芥、葡萄、青蒿、小麥和粳稻的相似系數分別為：97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析結果表明：WRKY基因在花瓣和副冠開花過程中的表達量發生變化，說明其可能參與多花水仙花朵的衰老過程。

關鍵詞 中國水仙；WRKY轉錄因子；基因克隆；序列分析

中圖分類號 S682.21 文獻標識碼 A

轉錄因子（transcription factor，TF），是位于細胞核內能夠與基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用的蛋白質分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉錄效應[1]。近年來，已相繼從高等植物中分離出一系列應對干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應及發育等相關基因表達的轉錄因子[2]。隨著人們對轉錄因子結構和功能的深入了解，人為的控制植物特定基因的表達來改良作物品質，已成為一種快捷、高效而頗具潛力的育種途徑。

WRKY作為植物體內的轉錄因子，其蛋白質N-端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，C-端含有1個鋅指型結構（Cys2His2或Cys2His/Cys），通過與靶基因啟動子區域W-box（C/TTGACT/C）的特異結合而調控基因的表達[3]。研究結果表明，WRKY轉錄因子家族參與調控植物的生長發育和各種生理進程，在一定程度上，可通過激活或抑制其他TF和調節WRKY基因的前饋和反饋循環，直接作用下游靶基因，其對水楊酸、機械損傷和病原防御等許多因子的應答具有迅速、短暫的特點[4-5]。Ishiguro等[6]最早從甘薯中發現WRKY因子，之后在野燕麥[7]、歐芹[8]，擬南芥[9]等植物中也相繼克隆和分離出WRKY。但尚未見到有關水仙WRKY轉錄因子基因的報道。為此，本研究以多花水仙為材料，根據多花水仙花瓣抑制消減雜交cDNA文庫[10]獲得的WRKY轉錄因子EST序列設計特異引物，利用RACE和RT-PCR技術克隆水仙WRKY基因全長，并對其進行生物信息學分析，為后續WRKY基因的功能研究及從轉錄水平上改善水仙的觀賞價值奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用的多花水仙主要有兩種類型：雙色花水仙‘金盞銀臺取自漳州水仙花生產地；‘黃花水仙2號，由福建農林大學園藝遺傳育種研究所提供。‘金盞銀臺副冠淺黃色，花瓣白色；‘黃花水仙2號花瓣和副冠均為黃色，花瓣顏色較副冠深。取花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期花朵，用鑷子小心除去花絲、花藥和柱頭，液氮速凍于-80 ℃下貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉錄 使用離心柱型多糖多酚RNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物限公司）分別提取‘金盞銀臺和‘黃花水仙2號花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期的花瓣與副冠的總RNA。用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（購自Fermenta）合成的cDNA用于3′-RACE。用Super SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（購自Contech公司）合成的cDNA用于5′-RACE。用SYBRPrimeScriptRT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒（購自TaKaRa）合成的cDNA用于qRT-PCR。具體的RT反應參照Fermenta、Contech和TaKaRa公司的使用說明書。

1.2.2 PCR引物的設計與合成 根據課題組已經獲得的WRKY轉錄因子片段和多花水仙的EST序列設計特異引物（見表1）。引物合成和基因測序均委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.3 ‘黃花水仙2號WRKY基因cDNA全長克隆

以‘黃花水仙2號的cDNA為模板分別進行5′-RACE和3′-RACE的擴增。反應體系均采用25 μL和35 cycle、退火時間均為90 s。3′端序列的克隆，第一輪PCR反應上下游引物分別為：WRKY 3′-1和AUAP。第一輪PCR反應產物稀釋10倍作為模板，以WRKY 3′-2和AUAP為引物進行第二輪擴增。5′端序列的克隆，以WRKY 5′-1和UPM為引物進行第一輪擴增，將第一輪產物稀釋10倍為模板，以WRKY 5′-2和UPM為引物進行第二輪擴增。

1.2.4 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺ORF的獲得

測序結果用Sequencher4.2除去18-T和通用引物序列，拼接WRKY基因的5′端、3′端，并于NCBI上預測其保守區。根據ORF兩端序列設計特異引物，以WRKY-F和WRKY-R分別為上下游引物擴增2種水仙的編碼區。凝膠電泳后回收目的片段，連接至PGEM載體并轉化DH5α（Escherichia coli.），菌液鑒定后測序。

1.2.5 序列拼接及生物信息學分析 引物設計、序列拼接及分析使用DNAMAN、Primer5.0和Sequencher4.2。氨基酸多重序列比對和CDD功能區域分析使用NCBI中的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；氨基酸理化分析使用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）；構建系統進化樹使用MEGA5.05中的鄰近相法neighbor-joining tree；氨基酸序列信號肽預測使用SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）；氨基酸序列跨膜預測使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；亞細胞定位使用softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）。

1.2.6 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺qRT-PCR的檢測與分析 將2種水仙的cDNA模板稀釋5倍，以actin（genebank acession： JN204912.1）為內參基因，WRKY-U和WRKY-D為上下游引物來檢測WRKY基因在2種水仙不同時期的轉錄水平。使用25 μL qRT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，每個樣品設置3次重復。qRT-PCR程序為：Stage1： 預變性，94 ℃，3 min；Stage2： PCR反應，94 ℃變性15s；56 ℃退火35 s，循環40 cycle。Stage3： Dissociation。反應結束后，分析Bio-Rad CFX96中的熔解曲線和擴增曲線，導出數據。從不同時期的相關基因擴增曲線中得到Ct值，通過actin的校正最終得到目的基因的相對表達量。

1.3 數據處理

采用2-△△ct（Livak）法，并用Excel和geNorm程序處理和分析熒光數據。

2 結果與分析

2.1 多花水仙WRKY基因cDNA全長克隆

以‘黃花水仙2號RNA反轉錄成的cDNA為模板，用特異引物進行PCR反應，PCR產物電泳檢測。結果顯示，5′RACE和3′RACE分別得到1條與預測相當約為600 bp的片段（見圖1）。測序后將其同原始EST序列拼接，得到長度為1 122 bp的序列，開放閱讀框945 bp，5′端非編碼區85 bp，3′端非編碼區92 bp，初步判斷已經獲得WRKY基因的cDNA全長。

2.2 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺WRKY基因ORF的獲得與分析

根據拼接的‘黃花水仙2號的cDNA全長，設計上下游引物，克隆‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺WRKY基因的開放閱讀框。結果擴增出大約1 000 bp的條帶（見圖1）。測序結果表明，‘黃花水仙2號ORF為945 bp，編碼314個氨基酸；‘金盞銀臺ORF為951 bp，編碼316個氨基酸。‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺的WRKY基因分別命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b。

2.3 多花水仙WRKY的生物信息學分析

利用ExPASy-ProtParam等在線工具推測2種水仙WRKY蛋白的基本理化性質（見表2），2種水仙WRKY都屬于酸性和疏水性蛋白，且等電點均為5.09。由于氨基酸的個別差異，可能導致了它們在蛋白質分子量、分子式、GRAVY值和不穩定指數上的不同。綜合推測2種類型的水仙WRKY蛋白均不存在信號肽，為非分泌蛋白。其跨膜螺旋數均為0，未形成跨膜區域，不是膜蛋白，且亞細胞均定位于葉綠體上的可能性比較大。

保守區域分析結果表明，該蛋白屬于WRKY超基因家族的成員。對其開放閱讀框所推導的氨基酸進行同源序列分析（見圖2），黃花水仙2號同擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_178199.1）、葡萄（Vitis pseudoreticulata，AEN71143.1）、青蒿（Artemisia annua，ADI56655.1）、小麥（Triticum aestivum，AFW98256.1）、粳稻（Oryza sativa Japonica，NP_

001046094.1）的同源性分別為：45%、43%、47%、41%、43%，說明這個基因的保守性差；‘黃花水仙2號與‘金盞銀臺亦存在一定的差異，同源性為：97.27%。為了研究WRKY的進化關系，構建了WRKY的系統進化樹（見圖3），結果表明，‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺處于同一分支，與‘黃花水仙2號進化比較相近的為粳稻，其次是大麥和小米，再就是玉米，二穗短柄草，它們都屬于單子葉植物，與雙子葉植物華東葡萄、蘋果、青蒿等進化距離相對較遠。總體上，此進化樹與植物分類學基本一致。

2.4 多花水仙WRKY在不同發育期的表達分析

在多花水仙開花的過程中，同一品種不同時期WRKY基因表達量的結果顯示（見圖4）：NtWRKY40a的轉錄水平在花瓣（P）和副冠（C）上有類似的變化趨勢，即在前花蕾期、始花期和盛花期呈上升趨勢，在衰敗期表現為下調；花瓣和副冠中相臨花期NtWRKY40a基因表達量相差分別約為5倍和4倍，但C較P轉錄水平低。P和C中NtWRKY40b的表達量在花蕾、始花、盛花期差異不顯著，差別較小，但在衰敗期表現為明顯差異，較前3花期比值分別為10和5倍左右，與NtWRKY40a相似，NtWRKY40b在C中的轉錄水平較P低。

3 討論與結論

WRKY轉錄因子是植物轉錄調節的超基因家族之一，也是調控植物信號網絡必不可少的部分。WRKY基因在植物中的表達是非組成性的，具有瞬時、迅速、組織特異性的特點。一般將WRKY蛋白分為3大類型：Ⅰ類含有2個WRKY保守結構域，鋅指結構為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H；Ⅱ類含有1個保守域，鋅指結構與第Ⅰ類相同，目前已發現的WRKY大多數是此類型；Ⅲ類也有1個保守域，但鋅指結構為C-X7-C-X22-23-H-X-C[4]。本研究中NtWRKY40a和NtWRKY40b均有1個WRKY保守域和1個鋅指結構，因此屬于第Ⅲ類WRKY蛋白。已研究的第Ⅲ類WRKY轉錄因子幾乎全和植物的生物脅迫應答有關，2種水仙WRKY在開花過程中均呈現出一定的階段性和時序性，可能是多花水仙參與自然共同進化及對不同環境適應性衍化的結果。

伴隨植物的進化，衰老是不可避免的過程，通常被認為是細胞程序性死亡的一種類型并由細胞內外信號所控制[11]。目前，植物衰老的原因還不清楚，植物衰老研究對提高農業產品器官質量、作物增產及優良性狀保持等有重大意義。已有的基因組和轉錄組結果顯示，許多轉錄因子家庭基因參與了植物的衰老調控，如WRKY、bZIP、NAC和MYB等。Robatzek等[12]研究已經證明AtWRKY6與擬南芥葉片的衰老有關，不同器官的轉錄水平顯示，AtWRKY6在根、花朵、衰老的葉片中有很高的表達量。也有研究者發現AtWRKY70的功能缺失突變體及OsWRKY23的過表達分別會加速擬南芥和水稻提前衰老[13-14]。本研究中，多花水仙WRKY基因的轉錄水平表明，花瓣和副冠中的NtWRKY40a在盛花期和衰敗期表達量均最高，較花蕾期和始花期有明顯差異，這可能與NtWRKY40a參與了‘黃花水仙2號花瓣的衰老過程有關；NtWRKY40b在花瓣和副冠的前3個時期的轉錄水平沒有顯著差異，而在衰敗期表現出較大差異，這可能是衰老誘導了‘金盞銀臺花朵中WRKY基因表達量的增加。第4個時期的NtWRKY40b及整個花期的NtWRKY40a在花瓣和副冠中的轉錄水平差異很大，但具體相關機理尚不清楚，有待于課題組進一步研究。

隨著研究的不斷深入，WRKY轉錄因子的功能也日益揭示出來。近年來，WRKY基因的研究主要集中在擬南芥等模式植物和水稻等經濟作用的基因克隆和功能分析中，而尚未涉及有關多花水仙WRKY基因的報道。本研究中，首次從多花水仙中分離出WRKY基因，并對其生物信息學進行初步分析，將有助于研究該基因功能，為下一步利用基因工程在轉錄水平上調控中國水仙的生長發育奠定了基礎。

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責任編輯：沈德發