多花水仙WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆與序列分析

李歡 何炎森 李科 申艷紅 吳用 陳曉靜

摘 要 以‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺為材料，根據(jù)課題組已克隆出的多花水仙轉(zhuǎn)錄因子WRKY基因片段設(shè)計特異引物，通過RACE技術(shù)分別從2個水仙品種中克隆出2個不同的WRKY基因，命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b，開放閱讀框（ORF）長度分別為945和951個堿基。序列分析結(jié)果表明，兩序列均含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域；‘黃花水仙2號與‘金盞銀臺、擬南芥、葡萄、青蒿、小麥和粳稻的相似系數(shù)分別為：97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析結(jié)果表明：WRKY基因在花瓣和副冠開花過程中的表達(dá)量發(fā)生變化，說明其可能參與多花水仙花朵的衰老過程。

關(guān)鍵詞 中國水仙；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；序列分析

中圖分類號 S682.21 文獻標(biāo)識碼 A

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），是位于細(xì)胞核內(nèi)能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[1]。近年來，已相繼從高等植物中分離出一系列應(yīng)對干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)及發(fā)育等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[2]。隨著人們對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，人為的控制植物特定基因的表達(dá)來改良作物品質(zhì)，已成為一種快捷、高效而頗具潛力的育種途徑。

WRKY作為植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白質(zhì)N-端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，C-端含有1個鋅指型結(jié)構(gòu)（Cys2His2或Cys2His/Cys），通過與靶基因啟動子區(qū)域W-box（C/TTGACT/C）的特異結(jié)合而調(diào)控基因的表達(dá)[3]。研究結(jié)果表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和各種生理進程，在一定程度上，可通過激活或抑制其他TF和調(diào)節(jié)WRKY基因的前饋和反饋循環(huán)，直接作用下游靶基因，其對水楊酸、機械損傷和病原防御等許多因子的應(yīng)答具有迅速、短暫的特點[4-5]。Ishiguro等[6]最早從甘薯中發(fā)現(xiàn)WRKY因子，之后在野燕麥[7]、歐芹[8]，擬南芥[9]等植物中也相繼克隆和分離出WRKY。但尚未見到有關(guān)水仙WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的報道。為此，本研究以多花水仙為材料，根據(jù)多花水仙花瓣抑制消減雜交cDNA文庫[10]獲得的WRKY轉(zhuǎn)錄因子EST序列設(shè)計特異引物，利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆水仙WRKY基因全長，并對其進行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)WRKY基因的功能研究及從轉(zhuǎn)錄水平上改善水仙的觀賞價值奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用的多花水仙主要有兩種類型：雙色花水仙‘金盞銀臺取自漳州水仙花生產(chǎn)地；‘黃花水仙2號，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝遺傳育種研究所提供。‘金盞銀臺副冠淺黃色，花瓣白色；‘黃花水仙2號花瓣和副冠均為黃色，花瓣顏色較副冠深。取花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期花朵，用鑷子小心除去花絲、花藥和柱頭，液氮速凍于-80 ℃下貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用離心柱型多糖多酚RNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物限公司）分別提取‘金盞銀臺和‘黃花水仙2號花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期的花瓣與副冠的總RNA。用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（購自Fermenta）合成的cDNA用于3′-RACE。用Super SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（購自Contech公司）合成的cDNA用于5′-RACE。用SYBRPrimeScriptRT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒（購自TaKaRa）合成的cDNA用于qRT-PCR。具體的RT反應(yīng)參照Fermenta、Contech和TaKaRa公司的使用說明書。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)課題組已經(jīng)獲得的WRKY轉(zhuǎn)錄因子片段和多花水仙的EST序列設(shè)計特異引物（見表1）。引物合成和基因測序均委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.3 ‘黃花水仙2號WRKY基因cDNA全長克隆

以‘黃花水仙2號的cDNA為模板分別進行5′-RACE和3′-RACE的擴增。反應(yīng)體系均采用25 μL和35 cycle、退火時間均為90 s。3′端序列的克隆，第一輪PCR反應(yīng)上下游引物分別為：WRKY 3′-1和AUAP。第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，以WRKY 3′-2和AUAP為引物進行第二輪擴增。5′端序列的克隆，以WRKY 5′-1和UPM為引物進行第一輪擴增，將第一輪產(chǎn)物稀釋10倍為模板，以WRKY 5′-2和UPM為引物進行第二輪擴增。

1.2.4 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺ORF的獲得

測序結(jié)果用Sequencher4.2除去18-T和通用引物序列，拼接WRKY基因的5′端、3′端，并于NCBI上預(yù)測其保守區(qū)。根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計特異引物，以WRKY-F和WRKY-R分別為上下游引物擴增2種水仙的編碼區(qū)。凝膠電泳后回收目的片段，連接至PGEM載體并轉(zhuǎn)化DH5α（Escherichia coli.），菌液鑒定后測序。

1.2.5 序列拼接及生物信息學(xué)分析 引物設(shè)計、序列拼接及分析使用DNAMAN、Primer5.0和Sequencher4.2。氨基酸多重序列比對和CDD功能區(qū)域分析使用NCBI中的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；氨基酸理化分析使用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）；構(gòu)建系統(tǒng)進化樹使用MEGA5.05中的鄰近相法neighbor-joining tree；氨基酸序列信號肽預(yù)測使用SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）；氨基酸序列跨膜預(yù)測使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；亞細(xì)胞定位使用softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）。

1.2.6 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺qRT-PCR的檢測與分析 將2種水仙的cDNA模板稀釋5倍，以actin（genebank acession： JN204912.1）為內(nèi)參基因，WRKY-U和WRKY-D為上下游引物來檢測WRKY基因在2種水仙不同時期的轉(zhuǎn)錄水平。使用25 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。qRT-PCR程序為：Stage1： 預(yù)變性，94 ℃，3 min；Stage2： PCR反應(yīng)，94 ℃變性15s；56 ℃退火35 s，循環(huán)40 cycle。Stage3： Dissociation。反應(yīng)結(jié)束后，分析Bio-Rad CFX96中的熔解曲線和擴增曲線，導(dǎo)出數(shù)據(jù)。從不同時期的相關(guān)基因擴增曲線中得到Ct值，通過actin的校正最終得到目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用2-△△ct（Livak）法，并用Excel和geNorm程序處理和分析熒光數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花水仙WRKY基因cDNA全長克隆

以‘黃花水仙2號RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，用特異引物進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳檢測。結(jié)果顯示，5′RACE和3′RACE分別得到1條與預(yù)測相當(dāng)約為600 bp的片段（見圖1）。測序后將其同原始EST序列拼接，得到長度為1 122 bp的序列，開放閱讀框945 bp，5′端非編碼區(qū)85 bp，3′端非編碼區(qū)92 bp，初步判斷已經(jīng)獲得WRKY基因的cDNA全長。

2.2 ‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺WRKY基因ORF的獲得與分析

根據(jù)拼接的‘黃花水仙2號的cDNA全長，設(shè)計上下游引物，克隆‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺WRKY基因的開放閱讀框。結(jié)果擴增出大約1 000 bp的條帶（見圖1）。測序結(jié)果表明，‘黃花水仙2號ORF為945 bp，編碼314個氨基酸；‘金盞銀臺ORF為951 bp，編碼316個氨基酸。‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺的WRKY基因分別命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b。

2.3 多花水仙WRKY的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam等在線工具推測2種水仙WRKY蛋白的基本理化性質(zhì)（見表2），2種水仙WRKY都屬于酸性和疏水性蛋白，且等電點均為5.09。由于氨基酸的個別差異，可能導(dǎo)致了它們在蛋白質(zhì)分子量、分子式、GRAVY值和不穩(wěn)定指數(shù)上的不同。綜合推測2種類型的水仙WRKY蛋白均不存在信號肽，為非分泌蛋白。其跨膜螺旋數(shù)均為0，未形成跨膜區(qū)域，不是膜蛋白，且亞細(xì)胞均定位于葉綠體上的可能性比較大。

保守區(qū)域分析結(jié)果表明，該蛋白屬于WRKY超基因家族的成員。對其開放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸進行同源序列分析（見圖2），黃花水仙2號同擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_178199.1）、葡萄（Vitis pseudoreticulata，AEN71143.1）、青蒿（Artemisia annua，ADI56655.1）、小麥（Triticum aestivum，AFW98256.1）、粳稻（Oryza sativa Japonica，NP_

001046094.1）的同源性分別為：45%、43%、47%、41%、43%，說明這個基因的保守性差；‘黃花水仙2號與‘金盞銀臺亦存在一定的差異，同源性為：97.27%。為了研究WRKY的進化關(guān)系，構(gòu)建了WRKY的系統(tǒng)進化樹（見圖3），結(jié)果表明，‘黃花水仙2號和‘金盞銀臺處于同一分支，與‘黃花水仙2號進化比較相近的為粳稻，其次是大麥和小米，再就是玉米，二穗短柄草，它們都屬于單子葉植物，與雙子葉植物華東葡萄、蘋果、青蒿等進化距離相對較遠(yuǎn)。總體上，此進化樹與植物分類學(xué)基本一致。

2.4 多花水仙WRKY在不同發(fā)育期的表達(dá)分析

在多花水仙開花的過程中，同一品種不同時期WRKY基因表達(dá)量的結(jié)果顯示（見圖4）：NtWRKY40a的轉(zhuǎn)錄水平在花瓣（P）和副冠（C）上有類似的變化趨勢，即在前花蕾期、始花期和盛花期呈上升趨勢，在衰敗期表現(xiàn)為下調(diào)；花瓣和副冠中相臨花期NtWRKY40a基因表達(dá)量相差分別約為5倍和4倍，但C較P轉(zhuǎn)錄水平低。P和C中NtWRKY40b的表達(dá)量在花蕾、始花、盛花期差異不顯著，差別較小，但在衰敗期表現(xiàn)為明顯差異，較前3花期比值分別為10和5倍左右，與NtWRKY40a相似，NtWRKY40b在C中的轉(zhuǎn)錄水平較P低。

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的超基因家族之一，也是調(diào)控植物信號網(wǎng)絡(luò)必不可少的部分。WRKY基因在植物中的表達(dá)是非組成性的，具有瞬時、迅速、組織特異性的特點。一般將WRKY蛋白分為3大類型：Ⅰ類含有2個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H；Ⅱ類含有1個保守域，鋅指結(jié)構(gòu)與第Ⅰ類相同，目前已發(fā)現(xiàn)的WRKY大多數(shù)是此類型；Ⅲ類也有1個保守域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C-X7-C-X22-23-H-X-C[4]。本研究中NtWRKY40a和NtWRKY40b均有1個WRKY保守域和1個鋅指結(jié)構(gòu)，因此屬于第Ⅲ類WRKY蛋白。已研究的第Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子幾乎全和植物的生物脅迫應(yīng)答有關(guān)，2種水仙WRKY在開花過程中均呈現(xiàn)出一定的階段性和時序性，可能是多花水仙參與自然共同進化及對不同環(huán)境適應(yīng)性衍化的結(jié)果。

伴隨植物的進化，衰老是不可避免的過程，通常被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的一種類型并由細(xì)胞內(nèi)外信號所控制[11]。目前，植物衰老的原因還不清楚，植物衰老研究對提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)品器官質(zhì)量、作物增產(chǎn)及優(yōu)良性狀保持等有重大意義。已有的基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，許多轉(zhuǎn)錄因子家庭基因參與了植物的衰老調(diào)控，如WRKY、bZIP、NAC和MYB等。Robatzek等[12]研究已經(jīng)證明AtWRKY6與擬南芥葉片的衰老有關(guān)，不同器官的轉(zhuǎn)錄水平顯示，AtWRKY6在根、花朵、衰老的葉片中有很高的表達(dá)量。也有研究者發(fā)現(xiàn)AtWRKY70的功能缺失突變體及OsWRKY23的過表達(dá)分別會加速擬南芥和水稻提前衰老[13-14]。本研究中，多花水仙WRKY基因的轉(zhuǎn)錄水平表明，花瓣和副冠中的NtWRKY40a在盛花期和衰敗期表達(dá)量均最高，較花蕾期和始花期有明顯差異，這可能與NtWRKY40a參與了‘黃花水仙2號花瓣的衰老過程有關(guān)；NtWRKY40b在花瓣和副冠的前3個時期的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異，而在衰敗期表現(xiàn)出較大差異，這可能是衰老誘導(dǎo)了‘金盞銀臺花朵中WRKY基因表達(dá)量的增加。第4個時期的NtWRKY40b及整個花期的NtWRKY40a在花瓣和副冠中的轉(zhuǎn)錄水平差異很大，但具體相關(guān)機理尚不清楚，有待于課題組進一步研究。

隨著研究的不斷深入，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能也日益揭示出來。近年來，WRKY基因的研究主要集中在擬南芥等模式植物和水稻等經(jīng)濟作用的基因克隆和功能分析中，而尚未涉及有關(guān)多花水仙WRKY基因的報道。本研究中，首次從多花水仙中分離出WRKY基因，并對其生物信息學(xué)進行初步分析，將有助于研究該基因功能，為下一步利用基因工程在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控中國水仙的生長發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)