采后荔枝果皮中谷胱甘肽轉移酶基因的表達與酶活分析

張建平 賈彩紅 王家保 徐碧玉

摘 要 為探明荔枝谷胱甘肽轉移酶基因（LcGST）的表達與果皮褐變之間的關系，在荔枝cDNA芯片中獲得了荔枝LcGST全長cDNA序列（ABR15777）。該序列全長913 bp，5′-UTR長53 bp，3′-UTR長215 bp，含一個645 bp的完整開放閱讀框，編碼含214個氨基酸殘基的多肽。該氨基酸殘基序列與沙梨等物種的谷胱甘肽轉移酶蛋白相似性較高。基因表達分析表明，LcGST在常溫儲存條件下基因的最大表達量出現在24 h，在保濕儲存條件下，LcGST的最大表達量出現在48 h。GST酶活性測定結果表明，在常溫儲存條件下酶活性的最大值出現在24 h，在保濕儲存條件下酶活性的最大值出現在48 h。說明LcGST在荔枝果皮褐化過程中起重要作用。

關鍵詞 荔枝；胱甘肽轉移酶基因；表達；酶活

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果實采后會快速褐變，降低其商品價值[1]。荔枝采后果實迅速失水，果皮逐漸干裂，產生大量活性氧及自由基，這些活性氧及自由基導致膜脂過氧化的加速，同時荔枝果皮迅速褐變，因此，活性氧及自由基在荔枝采后果皮褐變過程中起著主要作用。有研究報道，植物體在受到脅迫后，植物體內會產生大量活性氧及自由基，而為了防止活性氧類和自由基的損傷，植物體內谷胱甘肽轉移酶（glutathione-S-transferase， GST）的含量會上升，催化清除植物體內的自由基，使植物免受損傷[2]。

GST是一種多功能酶，主要用于催化三肽的谷胱甘肽與疏水的、親電的化合物發生親電取代反應，而后通過選擇性ABC轉運蛋白將連有谷胱甘肽的代謝物質轉運入液泡，達到消除毒素的作用[3]。GSTs二聚體由結構域Ⅰ和結構域II兩部分組成，兩者之間由5～10個氨基酸殘基組成的可變連接區連接。結構域Ⅰ是還原型谷胱甘肽（GSH）的特異接合位點（G位點），由1組N-末端氨基酸殘基組成，結構域II是結合疏水性底物的位點（H位點），由C-末端氨基酸殘基組成[4]。GSTs最初是在20世紀60年代在動物體內首先被發現的[5]，隨即70年代，人們在玉米中發現了第一個植物的GST酶，從此，便逐漸在所有的動植物以及細菌、真菌中都發現了與GSTs相對應的酶或基因序列[5-6]。根據蛋白質的序列相似性、底物專一性、酶聯免疫反應、動力學特征、空間結構和是否能組成二聚體等特征，可以將植物GSTs基因家族分為8個類型，分別是Zeta、Theta、Tau、Phi、Lambda、DHAR（dehydroascorbate reductase）、TCHQD（etrachlorohydroquinone dehalogenase）和 EF1Bγ（the γ-subunit of the eukaryotictranslation elongation factor IB）[7]，其中Phi、Tau、Lambda和DHAR四類GSTs是植物所特有的[8]，Tau類和Phi類GSTs在植物中的分布最為廣泛，其中Phi類基因在植物的抗逆反應、細胞信號轉導、植物抗病等方面都發揮著重要作用[8-10]。西紅柿中的GST能阻止其體內的氧化傷害，抑制 Bax 蛋白誘導的細胞程序性死亡[11]。這表明有些GST在穩定細胞的氧化還原和調節細胞的程序性衰老方面起作用。

目前關于荔枝GST基因的研究報道較少，為進一步研究GST基因在荔枝采后果皮衰老過程中的作用機理，本研究從cDNA芯片中獲得了荔枝GST基因全長LcGST，并分析其序列特征，研究在常溫儲存和保濕儲存條件下GST基因的表達情況，并測定在常溫儲存和保濕儲存條件下的酶活性，探討果皮褐變與GST基因表達之間的關系，為進一步揭示果皮褐變機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 荔枝（妃子笑）采自華南熱帶農業大學果園（海南省儋州市寶島新村）。選摘生長健康，沒有病害，沒有蟲害，成熟度基本一致（雌花授粉受精后約70～90 d）的果實為試驗材料。

果實采后3 h運回實驗室，清水沖洗，自然晾干（約10 min左右），挑選大小基本一致、無病蟲害和機械損傷的果實用作處理。第一組放置于（25±1）℃溫度下貯藏，環境空氣相對濕度（70±5）%培養箱中儲存（常溫儲存處理）；第二組用保鮮膜封閉包裝后同樣放置于（25±1）℃溫度下貯藏，環境空氣相對濕度（70±5）%培養箱中儲存（保濕儲存處理）。兩組材料在一定時間段的時候，剝下果皮，放入液氮中速凍，于-70 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑 菌種E.coli DH5α由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所保存。cDNA合成試劑盒購自CLONTECH公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶購自上海申能博彩生物科技有限公司，引物合成委托上海生工生物工程技術服務有限公司，DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，克隆載體試劑盒pMD20-T Vector購自TAKARA公司。其它生化試劑和常規試劑均為分析純或超純。

1.2 方法

1.2.1 荔枝果皮總RNA提取 荔枝果皮總RNA 的提取采用改良CTAB法的步驟進行[12]。提取的總RNA根據Clonetech提供的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書，將10 μg總RNA反轉錄為單鏈cDNA。

1.2.2 荔枝果皮GST基因的獲得 GST基因根據本課題組荔枝cDNA芯片測序獲得的，將該基因序列進行BLAST比對發現，該基因為全長序列。根據基因序列設計引物，從cDNA中克隆GST基因的全長。GST基因的引物：5′端引物為：5′-ATGG

TGGTTAAAGTTTATGGAC；3′端引物為：CTAATAG

TAGGCAAGCTTCAT。PCR擴增按以下操作進行：在每個0.2 mL離心管中加入4 μL dNTP，5 μL 10×Taq buffter， 0.5 μL Taq酶，2 μL 5′端引物，2 μL 3′端引物，1 μL單鏈cDNA及33.5 μL無菌雙蒸水，總體積50 μL。94 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環后，72 ℃終延伸10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA回收試劑盒回收目的條帶，克隆到pMD20-T Vector載體上，序列送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.3 GST基因的RT-PCR半定量分析 根據GST基因和actin基因序列設計半定量PCR引物，每個基因片段大小在300 bp左右。GST基因5′端引物為：5′-CCTTTTGGGCAAGTTCCAGTAAT-3′；3′端引物為：5′-GCACCAACTTAACATCCTCCGTC-3′。actin基因5′端引物為：5′-ATCCTCCAATCCAG

ACACTGT-3′；3′端引物為：5′-CAGTGGTCGTACA

ACTGGTAT-3′。PCR擴增按以下操作進行：在每個0.2 mL離心管中加入12.5 μL PCR-Mix緩沖液，1 μL 5′端引物，1 μL 3′端引物，1 μL單鏈cDNA及9.5 μL無菌雙蒸水，總體積25 μL。94 ℃預變性3 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。

1.2.4 GST酶活性測定 取-70 ℃冰箱中保存的不同處理時間點（0、24、48、72 h）的果皮作為材料，每個處理樣品隨機選30片果皮，在每片果皮上隨機切取一部分，把切取的各部分混合，作為1個處理的實驗材料。所有處理重復3次。取上述處理的果皮，加入液氮和2% PVPP研磨，取大約1 g粉末轉入pH 7.8的50 mmol/L PBS緩沖液（含0.2 mmol/L EDTA和2 mmol/L的抗壞血酸），用冰冷卻。再12 000 g離心20 min，提取上清液用于測定酶的活性。酶活測定用1.5 mL反應液，1.5 mL反應體系中含：1.5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0），75 μL 100 mmol/L的GSH，15 μL GST待測液，然后加入75 μL 100 mmol/L的CDNB啟動反應，以不加CDNB的空白管為對照，測定OD340的變化。酶活單位：每分鐘催化1 μmol CDNB結合GSH的酶量為1個單位（1 U）[13]。

2 結果與分析

2.1 LcGST的序列分析

利用NCBI軟件對LcGST進行序列分析，發現荔枝果皮GST基因cDNA全長933 bp（GenBank登錄號為ABR15777），包含一個645 bp的完整開放讀碼框，編碼214個氨基酸多肽，5′（5′UTR）端含有一個53 bp的非編碼區序列，3′（3′UTR）端含有一個235 bp的非編碼區序列（圖1）。該基因編碼蛋白由結構域Ⅰ和結構域II兩部分組成，結構域I是谷胱甘肽（GSH）特異性結合位點（G位點，圖1中紅色框），結構域II是疏水底物的結合位點（H位點，圖1中藍色框），符合GST基因的特征（圖1），因此將其命名為LcGST。

Blastx比對結果表明，該基因推導的氨基酸殘基序列與沙梨、可可、苜蓿、葡萄和毛果楊蛋白序列相似性分別為72%、69%、68%、68%和67%，并且與他們的序列聚為一支（圖2）。

2.2 LcGST在常溫儲存和保濕儲存條件下的表達分析

利用半定量PCR對LcGST在常溫儲存條件下荔枝果皮中的表達情況進行分析，從圖3中可以看出，常溫處理的荔枝果皮LcGST相對表達量是先上升后下降的過程，在0～24 h之間是上升的過程，隨后表達量下降。

此外對LcGST在保濕處理條件下荔枝果皮中的表達進行了分析，從圖4中看出在保濕處理的條件下，荔枝果皮LcGST相對表達量在0～48 h之間其表達量逐漸升高，在48 h達到最高峰，接著降低。

2.3 GST酶活性的測定

對常溫儲存和保濕儲存處理后荔枝果皮中GST酶的活性進行測定，結果表明，常溫儲藏條件下GST酶活性在24 h迅速升高，酶活性達到一個峰值，隨后逐漸下降。保濕儲藏條件下GST酶活性沒有明顯的變化（圖5）。

3 討論

本研究在cDNA芯片的基礎上獲得了荔枝谷胱甘肽轉移酶LcGST的全長cDNA 序列（ABR15777），該序列推導的氨基酸殘基具谷胱甘肽（GSH）特異性結合位點（G位點）和疏水底物的結合位點（H位點），符合GST酶的特征。Blastx比對分析該氨基酸序列與沙梨的氨基酸序列一致性達72%。經過ExPASy網站ProtParam工具分析，LcGST基因編碼的蛋白質理論等電點為5.31，分子量為24.49 kD。

有研究結果表明，果皮褐變與果實失水有關[14-15]。果實失水主要發生在果皮[16-17]。隨果皮失水量增加，果皮褐變指數升高[16-20]，二者呈明顯正相關[16]。隨果皮失水量增加，果皮pH升高，高濕貯藏環境下果皮含水量高，pH上升較慢[16-17]，果皮褐化現象也較慢。這些結果說明果皮失水是導致果皮褐變的主要原因之一[21]。GST提供的過氧化物清除能力的提高在防止植物遭受脅迫誘導產生的氧化損傷過程中可能是一個關鍵因子[22]。本研究對GST基因在常溫儲存和保濕儲存下荔枝果皮中的表達進行分析，結果表明：在常溫儲存條件下，GST基因在24 h時表達量最大，而此時也是荔枝果皮開始褐化的時間；在保濕儲存的條件下，GST基因表達量的最大值出現在48 h，這在基因表達水平上初步說明了荔枝果皮褐變與GST基因有關。同時對GST酶的活性進行測定，結果表明在常溫儲存的條件下，荔枝在采后24 h內開始褐變的同時[21]，GST的酶活性達到一個峰值，此時荔枝的褐變指數也緩慢增加[23]，這初步說明在常溫儲存條件下，果皮失水、氧化嚴重，為了防止果皮褐化，防止活性氧類的損傷，荔枝果皮內的谷胱甘肽轉移酶（GST）的含量上升，從而催化清除果皮體內的自由基組織以防止果皮褐化。在后期荔枝果皮嚴重褐變則主要是由于酚類物質的酶促或非酶促反應生成黑色物質的累積所致[17]，而不受果皮內谷胱甘肽轉移酶的影響，所以后期GST酶的活性下降。在保濕儲存的條件下，荔枝果皮的褐化程度較慢，在儲存前3天荔枝果皮基本沒有褐化，荔枝果皮中的自由基含量很少，不需要GST酶清除果皮中的自由基，所以GST酶的活性一直保持較低的水平。這從生理學水平上也初步說明荔枝褐化與GST酶的活性相關。

綜上所述，GST基因的表達與酶活變化趨勢相吻合，說明在荔枝果皮褐化過程中GST酶在其過程中起作用，但GST酶在果皮褐變過程中具體起什么作用，還需進一步研究證實。

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責任編輯：趙軍明