不同基因型菜心游離小孢子培養和植株再生

曾小玲 方淑桂 朱朝輝 鐘開勤

福州市蔬菜科學研究所，福建福州 350111

摘 要 以11個不同基因型的菜心栽培品種為試材，研究不同培養條件對菜心游離小孢子胚誘導和植株再生的影響。結果有7個基因型材料獲得小孢子胚，從不同基因型誘導形成胚的頻率存在顯著差異，表明基因型是影響菜心小孢子胚發生的主要因素；第1天熱激培養時用170 g/L高濃度蔗糖培養之后轉換成含130 g/L蔗糖培養基能顯著提高小孢子胚誘導率；0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促進菜心小孢子誘導成胚；添加0.4 mg/L GA3可顯著提高菜心小孢子胚芽誘導率和平均每胚出芽數。7個基因型材料均誘導出再生植株，植株誘導率為100%。

關鍵詞 菜心；游離小孢子培養；基因型；植株再生

中圖分類號 S634 文獻標識碼A

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var.utilis Tsen et Lee.）是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的1個變種。其適應性強，可周年栽培，在我國南方大面積種植。菜心雜交育種研究起步晚，常規育種方法需經過雜交、回交和多代自交分離，選育出理想的純系需要5～6年的時間。通過游離小孢子培養能夠快速獲得大量雙單倍體植株（DH系），將顯隱性基因成為表現型，使優良性狀得到保留，大大縮短育種的年限，豐富育種資源，是一種快速、高效的育種途徑。國內外研究人員對蕓薹屬蔬菜小孢子胚胎發生機制和影響因素做了大量研究，相繼在蕓薹屬的多個種[1-8]上獲得成功。但是不同種間游離小孢子胚誘導各有其自身的規律，不能完全相互套用。有關菜心游離小孢子培養的文獻報道較少，朱允華等[9]僅從個別菜心基因型誘導出胚狀體，沒有形成再生植株。目前，菜心小孢子培養技術體系尚不完善，仍然有大量的具體問題需要探索。本試驗通過對11個基因型菜心進行游離小孢子培養，對影響菜心胚誘導率和植株再生技術的幾個關鍵影響因素進行探討，培育出小孢子再生植株，進一步完善菜心小孢子培養技術，為利用現有資源快速創造所需要的新育種材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

11個供試材料分別為‘翠綠（福州永榮種子有限公司）、‘東莞2號（福州臺農種業有限公司）、‘優選38號（武漢武昌神牛種苗商行）、‘華綠50天（廣州華綠種子有限公司）、‘翡翠（廣州市惠金農業科技有限公司）、‘綠寶（廣州市農業科學研究院）、‘一枝花（廣州廣南農業科技有限公司）、‘501（廣州市農業科學研究院）、‘翡翠尖葉（廣州市惠金農業科技有限公司）、‘青翠（廣東省良種引進服務公司）和‘碧綠（深圳市范記種子有限公司），均為常規種。2009年1月10日、2月28日、8月2日，2010年1月8日、2月23日、8月7日2年6批直播于福州市蔬菜科學研究所試驗田，常規管理，2中旬至4月和9月選取適宜花蕾進行游離小孢子培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離小孢子的分離、純化和培養 參照方淑桂等[10]的研究方法對菜心游離小孢子進行分離、純化和培養。在菜心的始花期，于上午9 ： 00前，選取無蟲眼的供試花蕾（蕾長2.0～3.0 mm，瓣藥比為1/3～4/5），先用75%酒精蕩洗20 s，再用有效氯含量≥8.0%的13%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，最后用無菌水蕩洗3次；挑取花蕾于研缽中，加入含蔗糖130 g/L高溫滅菌過的B5培養基，用研杵擠壓游離出小孢子，經孔徑50 μm的尼龍網布過濾收集在10 mL的玻璃離心管中；于1 000 r/min的離心機離心3 min，棄上清液，再加入10 mL的B5液體培養基懸浮小孢子，離心，棄上清液，重復3次；純化的游離小孢子懸浮培養于NLN13液體培養基中，以每皿3 mL分裝到60 mm×15 mm的無菌培養皿中，用Parafilm膜封口；將培養皿置于恒溫培養箱33 ℃熱激誘導24 h，之后轉入25 ℃靜止暗培養，至胚狀體出現。培養23 d后統計小孢子出胚數，計算出胚率。當幼胚開始轉綠即轉至MS培養基中，置于（25±1）℃、光強3 000 lx、光照14 h/d條件下培養。

1.2.2 小孢子發育過程的形態學觀察 培養的游離小孢子每天置于OLYMPUS-CX41倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 不同氣候條件對小孢子胚誘導的影響 以易出胚的基因型‘翠綠、‘翡翠尖葉為材料，記錄取樣前一天的氣溫，將出胚結果與取樣前一天的溫度對應，分析溫度對菜心出胚的影響，氣象資料由福州市氣象局提供。

1.2.4 不同蔗糖濃度對小孢子胚發生的影響 分別以難出胚基因型‘青翠、中等出胚基因型‘碧綠和‘優選38號、易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉為材料，參照于文佳等[11]的方法，將游離的小孢子進行3種方式處理：1）一直用含130 g/L蔗糖的NLN13培養基培養；2）用含130 g/L蔗糖的NLN13培養基熱激1 d后，重新離心更換為新鮮的含130 g/L蔗糖的NLN13培養基繼續培養；3）用含170 g/L蔗糖的NLN13培養基熱激1 d后，重新離心更換為含130 g/L蔗糖的NLN13培養基繼續培養。每個處理5皿，重復3次。23 d后統計小孢子的出胚數。

1.2.5 6-BA和NAA對小孢子胚誘導的影響 以中出胚基因型‘優選38號和難出胚基因型‘青翠單核晚期的花蕾為材料，將純化的小孢子分別懸浮在含不同質量濃度6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）（0.05、0.10、0.15 mg/L）和NAA（萘乙酸）（0.2、0.5、1.0 mg/L）組合的NLN13液體培養基（含蔗糖130 g/L）中培養。23 d后統計小孢子的出胚數。

1.2.6 激素對小孢子胚芽繼代的影響 由于擴繁需要，研究不同質量濃度的激素對再生芽的影響。采用L9（34）拉丁方設計，將‘碧綠獲得的小孢子胚狀體分別接種在含不同質量濃度6-BA（0.8、0.4、0 mg/L）、NAA（0.04、0.02、0 mg/L）和GA（0.8、0.4、0 mg/L）組合的9組固體培養基中（基礎培養基：MS+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂），23 d后統計菜心的胚芽誘導率。胚芽誘導率=出芽胚狀體數/接種胚狀體數×100%，平均每胚出芽數=再生芽總數/出芽胚狀體數。

1.2.7 小孢子胚芽的生根及馴化移栽 再生芽長至2 cm左右時，切下芽，并轉入生根固體培養基（1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂）中生根，長成小苗，植株經馴化后移栽到苗床。

1.3 數據分析

利用DPS6.5軟件對數據進行差異顯著性分析，Graphpad5.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 小孢子離體培養過程的形態學觀察

從OLYMPUS-CX41倒置顯微鏡觀察菜心游離小孢子發育過程的形態變化。剛游離的小孢子大部分呈近圓形，具有3條萌發溝，細胞核被大液泡擠到細胞一側，處于單核靠邊期。經熱激誘導處理1 d后，部分小孢子明顯膨大，細胞增大到原來的2倍左右，形狀為圓球形（圖1-a）。3 d后，部分膨大的小孢子開始第一次細胞分裂，再經橫向和縱向多次分裂，培養7 d分裂形成細胞團。10～16 d細胞團進一步發育形成球形胚、心形胚（圖1-b）、魚雷形胚、子葉胚，最后形成不同形狀的胚狀體（圖1-d）。部分膨大的小孢子為橫向均等分裂，繼續分裂形成多細胞團（圖1-c），逐漸形成肉眼可見的愈傷組織，這些愈傷組織的細胞之間松散而無序的連接在一起。可見菜心游離小孢子發育過程存在胚狀體途徑和愈傷組織途徑的2種不同途徑。

2.2 不同基因型小孢子胚誘導的差異比較

由表1可見，供試的11份材料中有7個基因型誘導出胚，占63.6%。其中‘翠綠和‘翡翠尖葉每蕾出胚數較高，分別為8.06胚/蕾和6.28胚/蕾；‘東莞2號、‘青翠和‘華綠50天的出胚數相對低些，均在1.50胚/蕾以下；‘翡翠、‘501、‘綠寶和‘一枝花在NLN13培養基中未誘導出胚，不同基因型的菜心小孢子出胚數有極顯著差異。根據小孢子出胚數的不同，可以把11個材料劃分為4類：易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉，平均出胚數大于5.0胚/蕾；中等出胚基因型‘碧綠和‘優選38號，平均出胚數為1.5～5.0胚/蕾；難出胚基因型‘東莞2號、‘青翠、‘華綠50天，平均出胚數為0～1.5胚/蕾；不能出胚基因型‘翡翠、‘501、‘綠寶和‘一枝花。在不能出胚的4個基因型中，觀察到‘一枝花的游離小孢子發生膨大和分裂，說明其具有產生胚狀體的潛力，可能是培養基中的某些外因抑制細胞團的繼續發育；‘501只觀察到細胞的膨大，說明‘501基因型對培養條件有一定的反應，但是細胞不能進一步分裂。在相同的處理條件下，游離小孢子胚的發生能力是受基因型調控的。

2.3 供體植株氣候條件對小孢子胚誘導的影響 由表2可見，供體植株的氣候條件對小孢子胚的誘導具有明顯影響。植株在夜間最低氣溫低于10 ℃和日間最高氣溫高于30 ℃條件下，小孢子誘導率大大降低。在夜間最低氣溫處于12 ℃左右，日間最高氣溫處于24 ℃左右胚誘導率較高，這段時間比較適合菜心游離小孢子培養。2月份和3月份的胚誘導強于9月份，9月份的出胚數量極少。

2.4 培養基的蔗糖濃度對菜心小孢子胚誘導的影響

圖2顯示，不同蔗糖濃度處理對難出胚基因型‘青翠、中出胚基因型‘碧綠和‘優選38號的出胚數造成極顯著差異，但對易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉則無顯著影響。其中對于難出胚基因型‘青翠，處理1和處理2不能誘導形成胚，處理3則能夠誘導形成胚，且出胚數達到每蕾0.97個；對于中出胚基因型‘碧綠和‘優選38號，處理1和處理2能夠不同程度地提高小孢子出胚數，以處理3效果最好，出胚數比處理1每蕾分別多2.72個和2.73個；易出胚基因型‘翠綠和‘翡翠尖葉對高糖處理的影響不大，處理3分別比處理1每蕾僅多0.29個和0.16個。

2.5 6-BA和NAA對小孢子胚誘導的影響

表3表明，添加適宜質量濃度配比的生長調節劑有利于提高菜心游離小孢子的產胚量，其中對不易出胚基因型的促進作用更加明顯。‘優選38號的產胚數從每花蕾1.06個增加到3.77個，提高了2倍多。在誘導培養基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA促進了難出胚基因型‘青翠誘導出胚。菜心誘導培養基中最適宜激素質量濃度配比是0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA。說明生長調節劑是影響小孢子胚發生的重要因素之一，不同基因型要求的植物激素組合和濃度不盡相同。

2.6 激素對胚狀體繼代的影響

將‘翠綠培養得到的生長良好的轉綠胚狀體（圖3-a）轉接到MS固體培養基上擴繁培養，產生叢生芽。經試驗研究（表4），在MS固體培養基中添加6-BA、NAA和GA3都能誘導出不定芽，胚芽誘導率在2.41%～58.53%，平均每胚出芽數在0.69～6.61，不同質量濃度激素組合處理間呈極顯著差異。其中添加0.4 mg/L GA3最有利于不定芽發生，胚芽誘導率最高，達到58.53%，平均出芽數為每胚6.61個，比其他處理形成的植株較粗壯（圖3-b），再經過2～3次繼代后進行生根培養形成小孢子幼苗。只添加NAA的繼代培養基中，胚芽誘導率最低，有些胚狀體在培養過程形成愈傷，最終褐化死亡（圖3-c）。添加6-BA和NAA的繼代培養基中，菜心小孢子的胚芽發生速度較慢，植株較弱，胚芽誘導率偏低。逐漸提高GA3的濃度，菜心胚芽的分化受到明顯抑制，在添加0.8 mg/L GA3的MS培養基中，菜心葉子慢慢變大變厚，形成很多次生胚。將幼苗轉接到1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂的生根培養基上培養獲得健壯的植株（圖3-d）。由此可見，適宜的激素濃度對不定芽的再生具有明顯促進作用，激素濃度過高或不適宜都會抑制胚芽的擴繁。菜心小孢子胚芽繼代的最適培養基是MS+0.4 mg/L GA3。

3 討論與結論

菜心基因型是影響小孢子培養的關鍵因素之一。在相同處理條件下，供試的11個基因型材料中有7份形成了小孢子胚，誘導成功率為63.6%，表明菜心的基因型決定了出胚率，基因型的反應范圍較高，這與前人[12-13]的研究結果相同。在實際工作中可以將容易培養的基因型與難培養的基因型雜交，通過遺傳改良的方法擴大小孢子胚胎發生的基因型范圍，獲取有用的基因。這種設想陳文輝等[14]在甘藍上進行了嘗試，并獲得了成功。在菜心上的應用目前還沒有報道，有待于今后的摸索，實現對優良性狀基因型的成功培養。

植株的生長環境也是影響小孢子培養成敗的因素之一，健康生活力強的供試植株是小孢子培養的基礎，植株生長環境如氣溫、光周期和光照條件影響胚或胚狀體的產量[15]。多數蕓薹屬植物生長在較低溫（日/夜，10 ℃/5 ℃）有利于小孢子的培養[16-17]。張鳳蘭[18]發現生長在14～18 h長日照，15～20 ℃條件下的大白菜‘HoMei植株，胚狀體發生率和植株再生率高。方淑桂等[19]證實在10～25 ℃下生長的大白菜植株有利于小孢子培養。菜心多數品種對光周期要求不嚴格，花芽分化主要受溫度影響。本試驗研究結果表明當晝夜氣溫在12～24 ℃時菜心胚誘導率較高，在夜溫低于10 ℃或日溫高于30 ℃時均不利于菜心游離小孢子的出胚；春季的夜溫比秋季的夜溫低，導致小孢子培養時的脫分化能力的提高。推測氣溫變化會改變小孢子的內源激素水平從而影響胚的發生，影響了小孢子發育的方向。菜心植株應在適宜大田溫度條件或在人工氣候室中栽培有利小孢子培養工作開展。

培養基中蔗糖的供應對小孢子的發生起著碳源、能源和調節滲透壓的重要作用，在小孢子培養研究中前人[20-21]多有討論。方淑桂等[21]研究花椰菜游離小孢子培養試驗表明太高或太低蔗糖濃度都不利于小孢子存活，胚誘導頻率最高的培養基蔗糖為130 g/L。本試驗游離小孢子熱激培養1 d時采用含170 g/L蔗糖的培養基，之后更換為含130 g/L蔗糖的誘導培養基繼續培養，青翠等不易出胚基因型的游離小孢子培養反應比較積極，小孢子膨大快，小孢子的出胚數得到顯著的提高；可能是剛游離的小孢子需要高濃度蔗糖來保持滲透壓，之后轉入低濃度蔗糖是促進細胞的進一步分裂。

現在越來越多的試驗證明添加適當濃度的激素可以促進細胞生長、分裂和不定芽的形成。馮輝等[22]研究了NAA和6-BA的不同質量濃度配比對胚誘導、胚再生、植株生根的影響。本試驗結果表明，不同激素組合和濃度對不同基因型小孢子出胚數的影響有顯著差異，在NLN13誘導培養基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA能夠極顯著的誘導小孢子出胚數；繼代培養基中添加低質量濃度GA3可以促進菜心胚芽長成數量多的不定芽，但高質量濃度的GA3對小孢子胚的繼代產生有抑制作用。

總之，影響小孢子培養和再生植株獲得的因素很多[23-26]，菜心小孢子培養技術需要進一步的研究與驗證，以便加快應用于生產。

參考文獻

[1] 袁素霞， 劉玉梅， 方智遠， 等. 結球甘藍和青花菜小孢子胚植株再生[J]. 植物學報， 2010（2）： 226-232.

[2] 宋立曉， 馮 翠， 曾愛松， 等. 影響青花菜游離小孢子培養胚胎發生的因子[J]. 江蘇農業學報， 2010， 26（6）： 1 319-1 322.

[3] 姚秋菊， 蔣武生， 原玉香， 等. 游離小孢子培養育成早熟大白菜新品種‘豫新58[J]. 園藝學報， 2008， 35（6）： 929-929.

[4] 成 妍， 班青宇， 王 倩， 等. 不結球白菜游離小孢子培養及再生植株的倍性鑒定[J]. 南京農業大學學報， 2009， 32（2）： 25-29.

[5] Chanana N P， Dhawan V， Bhojwani S S， et al. Morphogenesis in isolated microspore cultures of Brassica juncea[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2005， 83： 169-177

[6] Takahashi Y， Yokoi S， Takahata Y. Effects of genotypes and culture conditions on microspore embryogenesis and plant regeneration in several subspecies of Brassica rapa L.[J]. Plant Biotechnol Rep， 2012， 6： 297-304

[7] Lionneton E， Beuret W， Delaitre C， et al. Improved microspore culture and doubled-haploid plant regeneration in the brown condiment mustard（Brassica juncea）[J]. Plant Cell Reports， 2001， 20： 126-130

[8] Wang T T， Li H X， Zhang J H， et al. Initiation and development of microspore embryogenesis in recalcitrant purple flowering stalk（Brassica campestris ssp.chinensis var.purpurea Hort.）genotypes[J]. Scientia Horticulturae， 2009， 121： 419-424.

[9] 朱允華， 劉明月， 吳朝林. 影響菜心游離小孢子培養的因素[J]. 長江蔬菜， 2003（9）： 46-47.

[10] 方淑桂， 陳文輝， 曾小玲， 等. 大白菜游離小孢子培養技術研究初報[J]. 福建農業學報， 2003， 18（2）： 123-126.

[11]于文佳， 侯喜林， 趙曉嫚， 等. 小菘菜游離小孢子培養和植株再生[J]. 南京農業大學學報， 2013（2）： 4.

[12] 顧宏輝， 唐桂香， 張國慶， 等. 冬性花椰菜的小孢子胚誘導和植株再生研究[J]. 浙江大學學報（農業與生命科學版）， 2004， 30（1）： 34-38.

[13] Cheng Y， Ma R， Jiao Y， et al. Impact of genotype， plant growth regulators and activated charcoal on embryogenesis induction in microspore culture of pepper（Capsicum annuum L.）[J]. South African Journal of Botany， 2013， 88： 306-309.

[14] 陳文輝， 方淑桂， 曾小玲， 等. 甘藍和青花菜雜種小孢子培養[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2006， 14（4）： 321-326.

[15] Ferrie A M R， Irmen K I， Beattie A D， et al. Isolated microspore culture of oat（Avena sativa L.）for the production of doubled haploids： effect of pre～culture and post～culture conditions[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture（PCTOC）， 2014， 116（1）： 89-96.

[16] Baillie A M R， Epp D J， Hutcheson D， et al. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris[J]. Plant cell reports， 1992， 11（5～6）： 234-237.

[17] Takahata Y， Brown D C W， Keller W A. Effect of donor plant age and inflorescence age on microspore culture of Brassica napus L[J]. Euphytica， 1991， 58（1）： 51-55.

[18] 張鳳蘭. 環境條件對白菜小孢子培養的影響[J]. 華北農學報， 1994， 9（1）： 95-100.

[19] 方淑桂， 陳文輝， 曾小玲， 等. 大白菜游離小孢子培養技術研究初報[J]. 福建農業學報， 2003， 18（2）： 123-126.

[20] 張曉芬， 王曉武， 張延國， 等. 花椰菜游離小孢子培養再生植株研究[J]. 中國蔬菜， 2005（1）： 16-17.

[21] 方淑桂， 朱朝輝， 曾小玲， 等. 花椰菜游離小抱子培養及影響因子[J]. 福建農業學報， 2006， 2（1）： 138-142

[22] 馮 輝， 郭 姝， 馮建云， 等. 菜用羽衣甘藍的小孢子胚誘導和植株再生[J]. 園藝學報， 2009， 36（4）： 587-592.

[23]張 慧， 汪承剛， 宋江華， 等. 蕓薹屬蔬菜游離小孢子成胚影響因素研究進展[J]. 中國農學通報， 2013， 29（10）： 92-96.

[24]董彥琪， 肖 艷， 段風華， 等. 大白菜游離小孢子培養和植株再生技術研究進展[J]. 中國瓜菜， 2012， 25（1）： 44-48.

[25] Ferrie A M R， Caswell K L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture（PCTOC）， 2011， 104（3）： 301-309.

[26] Takahata Y， Takahashi Y， Tsuwamoto R. Microspore Culture and Doubled Haploid Technology[M]//Biotechnology of Crucifers. Springer New York， 2013： 45-62.