qRT—PCR分析萊茵衣藻氮、硫同化相關基因的表達

李平 費小雯 李興涵 鄧曉東

摘 要 實驗發現，缺氮、缺硫的環境有利于萊茵衣藻油脂的積累，說明與氮、硫同化相關的基因也與油脂合成有著密切的關系。分析了氮、硫同化通路相關基因，選擇氮同化相關的6個基因（NAR3、NAR1.1、NII1、NIA1、NIT2、AOX1）以及硫同化相關的6個基因（SULP1、SIR1、SLT1、ARS1、SULTR1、ATS1）進行qRT-PCR分析。對萊茵衣藻CC124以及CC425藻株分別進行缺氮、缺硫處理，Trizol法連續提取4 d的RNA作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測基因的表達水平。結果發現，這12種基因均較對照上調表達，其中，萊茵衣藻氮、硫運載體基因上調表達非常顯著。缺氮條件下NAR3、NAR1.1較正常最高上調表達200倍；缺硫條件下SLT1較對照有1 000～2 000倍的mRNA表達量，SULTR2也最高能增高450倍的表達量。

關鍵詞 萊茵衣藻；缺氮；缺硫；qRT-PCR

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

隨著經濟的發展和技術的進步，各國對能源的需求日益增大，而傳統的化石能源日益枯竭，因此開發新的可再生能源成為當今世界各國關注的焦點[1]。同時，Zeller等[2]還研究了發展中國家生物燃料產業的前景和挑戰，及其糧食安全及全球糧食價格升高帶來的威脅。生物柴油作為一種新興的可再生生物能源，清潔環保，易生物降解，燃燒后排放的氮氧化物和CO2少，且可直接用于現有的柴油發動機，是良好的化石燃料替代物[3]。其中，微藻是制取生物柴油最有希望和前途的原料，具有分布廣泛、環境適應力強、生長迅速、油脂含量高等特點[4]。因此，對微藻進行深入的研究具有非常可觀的應用前景。

微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養豐富、光合利用度高的自養低等水生植物。在適宜條件下，微藻通常處于營養生長狀態，細胞內脂質含量較低，且多為極性脂（polar lipid），如磷脂（phosphor lipid）。而在脅迫條件下，細胞內很快積累大量中性脂（neutral lipid），如甘油三脂（triacylglycerol， TAG）[5]。其中，氮素是組成氨基酸的必要成分之一，氮素的缺乏直接限制光合膜蛋白以及包括葉綠素在內的其他色素分子的合成，最終影響光合放氧能力[6]，當植物缺硫時降解植物組織中的硫庫，釋放硫元素，表現為總蛋白和葉綠素含量降低[7]。李亞軍等[8]研究發現氮元素缺乏可誘導萊茵衣藻（Chlamydmonas reinhardtii）在細胞內大量積累三酰甘油。硫營養限制也能使微藻細胞的含油量大幅提高[9]。本研究分析氮、硫同化通路中的相關基因，意圖從這些基因中找到具有重要研究價值的基因。

本實驗室著重研究萊茵衣藻在能源方面的應用價值，研究發現，在缺氮、缺硫的條件下有利于油脂的積累，能夠在氮、硫同化中找到與油脂合成密切相關的基因，本次實驗運用實時熒光定量PCR的方法對相關基因進行初步的摸索，對以后的研究有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

藻株： Chlamydomonas reinhardtii CC124和細胞壁缺陷型的Chlamydomonas reinhardtii CC425（購于美國杜克大學衣藻中心）。

主要試劑及儀器：酶標儀（BIO-TEKELx800）；實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）購于TaKaRa公司；實時熒光定量PCR儀（STRATAGENE Mx3005）。

1.2 方法

1.2.1 萊茵衣藻的培養及相關生理生化指標的測定

（1）藻株生長曲線繪制及生物量測定。根據實驗藻在490 nm波長下有特定的吸收值[10]，用酶標儀（BIO-TEKELx800）分別測定8瓶不同時長500 mL培養的CC425藻株在490 nm下的吸光值，并對應稱取干重，根據吸光值與干重對應的關系，繪制CC425藻株干重標準曲線，得到本研究萊茵衣藻的生物量標準曲線y=0.599 4x-0.016 3[11]。

將CC124、CC425藻株分別接種于含有50 mL HSM培養基的100 mL三角瓶中，置于在25 ℃，全光照，光照強度3 000～4 500 lx的培養條件下220 r/min振蕩培養3～4 d至對數生長期。將藻液進行離心、富集，用少量HSM培養基進行稀釋、打勻，將CC124接入50 mL HSM、HSM-N培養基，CC425接入50 mL HSM和HSM-S的培養基中，HSM和HSM氮、硫元素缺乏培養基參照費小雯等[9]培養基的配制。通過血細胞計數法[12]在顯微鏡下數細胞，保證接入的藻液終濃度一致，細胞數約1×106～1×108個/mL左右，每種處理4～5瓶，于25 ℃，16 h光照（1 000～3 000 lx），8 h黑暗進行震蕩培養。培養期間每24 h取樣1次，使用酶標儀測量缺氮、缺硫條件下CC124和CC425藻液在490 nm處的吸光值，且每組實驗設5個平行，根據生物量標準曲線得藻株每日的生物量，并繪制藻株的生長曲線。

（2）藻株增長曲線繪制及其油脂含量。利用尼羅紅染色法測量油脂含量[13]首先繪制三酰甘油濃度標準曲線。在藻株培養的第48小時，取適當藻液進行離心、富集，取10 μL藻液加入0.2 μL 0.1 mg/mL尼羅紅染料和1.8 μL DMSO孵育10 min，分別測量在染色前后的吸光值，且每個樣設置5個平行。根據三酰甘油濃度標準曲線，計算每日的油脂含量，繪制油脂增長曲線。

（3）藻株狀態及油滴觀察。將以上培養的藻株在培養的2～3 d 時，對三角瓶中藻液的外觀狀態拍照。取10 μL的藻液制片，并加入1 μL的魯格式碘液固定細胞，使用濃度為0.2 μL 0.1 mg/mL的尼羅紅染色10 min，使用熒光顯微鏡進行白光和熒光對油滴進行觀察和拍照[14]。

1.2.2 相關基因引物設計及Real Time PCR

（1）藻種RNA的提取及cDNA合成。參照李亞軍等[8]RNA提取方法分別提取CC124和CC425第1、2、3、4天的動態RNA，并將提取的RNA進行變性和反轉錄，用于Real Time PCR的模板。

（2）引物的設計及合成。此次Real Time相關引物用Primer Premier5進行設計，設計的引物信息見表1[引物均為委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。

（3）SYBR實時定量PCR檢測。以連續4 d提取出的RNA做模板和以上合成的引物，每組設3個生物學重復。使用SYBR Premix Ex Taq（TakaRa）實時熒光定量試劑盒進行動態熒光定量PCR檢測，總反應體系為16 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）7.5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.3 μL，PCR正向引物1 μL，PCR反向引物1 μL，模板1 μL，雙蒸水5.2 μL，每組設3個平行，擴增條件為95 ℃反應1 min；95 ℃反應20 s和58 ℃反應20 s，循環40次。內參為：18S rRNA。

2 結果與分析

2.1 萊茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫條件下生理生化指標

2.1.1 藻株在缺氮、缺硫條件下生物量變化 由圖1、2可以看出，缺氮、缺硫的環境均使藻株的生物量下降，培養3～4 d，兩種逆境條件都使藻株生物量下降2～3倍。差異極顯著（通過SPSS軟件分析，p<0.01差異極顯著），說明缺氮、缺硫環境對萊茵衣藻的生長抑制作用很明顯。

2.1.2 藻株在缺氮、缺硫條件下油脂含量變化

在測量生物量的同時，對藻株每日的油脂含量進行測量，由圖3、4可以看出，缺氮、缺硫的環境有益于萊茵衣藻CC124、CC425油脂的積累，藻株培養3～4 d，在缺氮的條件下，相對于正常培養的CC124藻株油脂量積累增加了5～10倍，缺硫處理也能導致CC425藻株油脂含量增加5～6倍，差異極顯著（p<0.01）。

2.1.3 藻株在缺氮、缺硫條件下藻狀態及油滴顯微拍照 由圖5可以看出，缺氮、缺硫的環境會導致藻液顏色變黃，其中原因之一也有可能與圖1、2中藻株在缺氮、缺硫環境下生物量較少有關，并且與對照相比，油滴積累明顯增多。熒光暗場照片中黃色熒光代表以三酰甘油為主的中性脂。

2.2 實時定量PCR結果

2.2.1 與氮同化相關的基因在正常與缺氮條件下mRNA的表達水平 由圖6可以看出，在缺氮水平較正常條件相比，NAR3和NAR1.1這2個基因基因表達量明顯上升，最高能增高200倍左右；同時，NII1基因能較高水平地增高表達量，最高能到30倍左右；NIA1、NIT2、AOX1基因低水平地提高表達量，約1～10倍之間，其中NIA1前兩天其mRNA表達量較正常要低，經過3～4 d的培養之后，缺氮條件開始較正常表達量高。說明實驗的這6個基因在缺氮條件下表達量均升高，并且NAR3、NAR1.1促進效果更為顯著。

2.2.2 與硫同化相關的基因在正常與缺硫條件下mRNA的表達水平 由圖7可以看出，在缺硫條件下較正常相比，SLT1、ARS1、SULTR2、ATS1這4個基因mRNA表達量有很明顯的提高，其中SLT1增高了1 000～2 000倍，SULTR2也最高能增高450倍的表達量，ARS1、ATS1提高10～30倍，SULP1、SIR1的表達量提高了約2～5倍左右。

3 討論與結論

根據微藻產油相關報道，氮、硫同化相關的基因可能與油脂積累有間接的關系[31]，對TAP或者HSM培養基進行缺氮和缺硫處理，會導致萊茵衣藻中三酰甘油的大量聚集。實驗中的圖1～5也可以看出在缺氮、缺硫的環境會導致藻液狀態變黃，較正常相比，缺氮缺硫條件下的藻株油脂的積累明顯增高。由此筆者對氮、硫同化通路里典型的基因進行表達研究。實驗根據2-△△CT相對定量法通過計算得到目的基因相對于內參基因的表達量[32]，系統地把多個基因一起進行分析，方便快捷地得出實驗結論。從圖6和圖7中可以直觀地看出缺氮、缺硫能夠促進萊茵衣藻中氮同化或硫同化相關基因的表達。在圖6所示的缺氮環境中，NAR3和NAR1.1較對照mRNA表達量顯著提高，最高能達200倍，在圖7所示的缺硫環境中，SLT1較對照有1 000～2 000倍的mRNA表達量，SULTR2也最高能增高450倍的表達量。經過分析發現，這4個基因均分別是萊茵衣藻氮和硫的轉運載體基因，說明在缺氮，缺硫的條件對相應元素轉運載體基因的表達還是有著很大的影響。NAR在高等植物中受NO3-的誘導表達[33]，在N通路中發揮很重要的作用。在擬南芥缺硫狀態下研究發現，高親和性運輸載體對硫的應答是受轉錄水平調節，尤其是在長時間的缺硫狀態下，表達量明顯升高[34]。運載體在植物對礦物質元素吸收的過程中作用關鍵，本研究只是初步對相關的基因做了定量分析，而上述基因是否真正與油脂代謝有聯系，還需要通過對相關基因的缺失或過量表達進行分析，深入研究這些基因對萊茵衣藻中與油脂積累的影響才能得出結論。

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責任編輯：沈德發