低溫脅迫下椰子葉片解剖結構差異研究

曹紅星 黃漢駒 雷新濤 張大鵬 張如蓮

摘 要 以2年生的海南本地高種椰子和香水椰子2個椰子品種的幼苗為材料，根據溫度的日變化規律，設置4個不同的最低溫度處理，分別為CK（自然溫度處理）、16 ℃（T1處理）、12 ℃（T2處理）、8 ℃（T3處理），處理20 d后，對其植株的寒害癥狀及組織解剖結構變化進行研究。結果表明，隨著處理溫度的降低，葉片受傷害情況越來越嚴重，葉片結構越來越不規則，尤其在T3處理下香水椰子的葉片結構嚴重變形。葉片總厚度在不同低溫處理下變化明顯，可作為椰子抗寒種質鑒定時的結構指標，海南本地高種抗寒性比香水椰子強。

關鍵詞 椰子；低溫處理；解剖結構

中圖分類號 S667.4 文獻標識碼 A

椰子為棕櫚科椰子屬的喜溫樹種，是典型的熱帶木本油料作物和食品能源作物，在高溫和陽光充足的條件下生長發育良好。椰子要求年平均溫度在24～25 ℃以上，才能正常開花結果，一年中若有1個月的平均溫度為18 ℃，其產量則明顯下降，若平均溫度低于15 ℃，就會引起落花、落果和葉片變黃[1]。因此，低溫是影響椰子生長發育的重要限制因子，若椰子抗寒育種取得突破性進展，對提高其在低溫季節的產量、擴大種植范圍和面積，推動椰子產業的發展具有重要意義[2]。已有研究結果表明，低溫下葉片解剖結構的變化與抗寒性關系密切，通過研究野生歐洲李秋季和春季葉片解剖結構的差異發現，柵/海比（柵欄組織厚度/海綿組織厚度）和組織結構緊密度（CTR）與野生歐洲李的抗寒性顯著相關[3]；通過對14個早實核桃品種的抗寒性進行綜合評價表明，葉片厚度、氣孔密度和柵/海比是影響抗寒性的主要葉片組織結構指標[4]；有的研究認為抗寒性較強的植物在低溫處理過程中，柵欄細胞層數目多，葉脈密度較高[5]。植物葉片解剖結構鑒定已成為評價植物抗寒性的重要方法，并應用于不同種質抗寒性鑒定的研究中[6-10]。因此，開展椰子葉片解剖結構的研究對椰子抗寒種質材料的篩選具有重要意義。

在椰子解剖結構研究方面，對不同椰子品種的1年生幼苗葉片進行解剖觀察和比較，初步推測4個品種的抗寒能力依次為本地高種（綠）、本地高種（褐）、馬來亞紅矮、馬來亞黃矮[11]。通過對5個椰子品種成年植株葉片解剖結構進行研究發現，葉片的柵欄組織厚度和葉片厚度可以作為抗寒指標，在供試品種中，抗寒性最強的是海南本地高種，抗寒性最弱的文椰4號（香水椰子）。但是關于低溫對椰子解剖結構變化影響的研究還少見報道。本研究通過對2個椰子品種在低溫處理下葉片解剖結構的變化特性，篩選出與抗寒密切相關的結構指標和抗寒種質，為抗寒種質資源的早期篩選鑒定和抗寒品種的培育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試2個品種分別為海南本地高種椰子和香水椰子，取自海南省文昌市中國熱帶農業科學院椰子研究所育苗基地，選取生長健壯，長勢一致，無病害的2年生的盆栽苗。

1.2 方法

1.2.1 低溫脅迫處理 實驗于2013年1月6～26日進行，2個椰子品種分別選取生長一致的盆栽苗在植物光照培養箱中（型號：RXZ-280B）進行低溫脅迫，以自然環境溫度為CK（溫度范圍18～22 ℃），根據自然條件下溫度的日變化進行模擬，設置不同的最低溫度處理：T1（16 ℃）、T2（12 ℃）、T3（8 ℃）（表1）。各處理結束后，以頂端下第2～3片葉定為樣品葉進行石蠟切片，同時觀察植株出現的寒害癥狀，每處理3株，重復3次。

1.2.2 葉片解剖結構的測定 取頂端以下第3片葉，從葉片中部切取，避開中部較大的葉脈，切成5 mm×3 mm小片，經過材料固定、酒精梯度脫水（各20 min）、透明、浸蠟、包埋、按8～10 μm厚度切片、展片、番紅-固綠染色、中性樹膠封片、光學顯微鏡照相。制片后在Leica DM2500光學顯微鏡下物鏡40倍觀察拍照，用目鏡測微尺測量葉片厚度、上表皮厚度、上角質層厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質層厚度，并分別計算細胞緊密度（CTR）、疏松度（SR）。每個溫度處理觀察3個切片，每個切片取10個視野測定平均值。

1.3 數據分析

利用Excel軟件對原始數據進行統計，然后采用SPSS軟件，對測定的解剖結構指標數據進行方差分析和Duncan多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下植株的寒害表現

分別對2年生椰子在不同低溫脅迫下植株的寒害情況進行觀察。發現海南本地高種椰子在自然生長條件下（CK），椰子幼苗均生長正常，無萎蔫脫水的現象出現。隨著處理溫度的降低，植株受傷害情況逐漸加重。但是香水椰子在CK處理過程中，有輕度受害的現象出現，第17天開始出現葉片萎縮的現象，可能與實驗處理期間外界環境溫度較低（CK處理的最低溫度18 ℃），香水椰子的抗寒性較差有關（表2）。

在T1處理下，海南本地高種椰子的葉片第5天出現萎縮，而萎縮一直持續到第17天才出現了輕度的折疊，第20天葉片才有緊縮的現象；香水椰子的葉片第5天出現萎縮，第13天萎蔫，第16天葉片緊縮，第20天葉片折疊收緊。

在T2處理下，海南本地高種椰子和香水椰子都是第5天出現萎縮現象，海南本地高種椰子第16天才出現輕度的折疊，第20天葉片折疊收緊現象較為明顯，而香水椰子第10天出現萎蔫，第20天出現水漬狀。

在T3處理下，海南本地高種椰子還是第5天出現萎縮現象，第14天輕度折疊，第20天嚴重折疊；香水椰子第3天就出現萎縮現象，第16天就出現水漬狀，受害嚴重，第20天葉片全部變褐，嚴重失水。

2.2 低溫脅迫下葉片的解剖結構形態比較

對2個不同椰子品種在低溫處理下椰子解剖結構變化的顯微觀察發現，CK處理下的柵欄組織和海綿組織排列規則，但隨著溫度的下降，細胞間隙越來越大，排列越來越不規則；海綿組織邊緣規則，隨著處理溫度的降低，胞間隙擴大，邊緣越來越不規則。

由圖1可以看出，海南本地高種椰子的葉片細胞結構緊密程度遠高于香水椰子，在CK處理下，海南本地高種椰子的柵欄組織和海綿組織排列非常整齊﹑有規則，在T2和T3處理下，依然能保持著相對緊湊完整的葉片形態，只不過T3處理下海綿組織和柵欄組織的分界已經開始模糊不清；而香水椰子細胞結構在CK處理下，細胞結構排列不如海南本地高種椰子排列緊密，T2和T3處理下疏散，趨于破碎，尤其T3處理下，海綿組織和柵欄組織已不能區分，由此可知，海南本地高種椰子的葉片組織結構比香水椰子更耐受低溫寒害影響，T3處理可能溫度較低對實驗結果的觀察有一定的影響。

2.3 低溫脅迫下葉片組織解剖結構指標比較分析

海南本地高種椰子葉片組織解剖結構指標在不同低溫處理下的變化見表3，隨著處理溫度的降低，葉片總厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了2.92%、17.96%、13.05%，CK和T2、T3處理分別達到顯著差異水平，但T3處理的反而比T2處理的高；柵欄組織厚度和葉片總厚度表現出相類似的變化趨勢；海綿組織厚度在不同低溫處理下變化不大，僅有T2處理和另外3個處理達到顯著差異的水平；組織緊密度（CTR）在不同溫度處理下比較穩定，各處理之間都未達到顯著差異的水平；組織疏松度（SR）在不同低溫處理下變化不大，僅CK和T3處理達到顯著差異的水平；柵欄組織與海綿組織比（P/I）在不同溫度處理下也表現比較穩定，各處理間都未達到顯著差異的水平。

香水椰子的葉片總厚度，隨著處理溫度的降低，葉片總厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了23.50%、25.10%、6.47%，但CK和T3處理的葉片總厚度顯著高于T1和T2處理；柵欄組織厚度也表現出和葉片總厚度相類似的變化特征，T1、T2、T3處理的柵欄組織厚度與CK相比，分別減少了26.18%、27.07%、3.32%，CK和T3處理的柵欄組織厚度也顯著高于T1和T2處理；海綿組織厚度在低溫處理過程中變化差異較大，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了43.15%、33.33%、19.86%，CK和T1、T2、T3處理分別達到顯著差異的水平；組織緊密度（CTR）在不同溫度處理下變化不大，各處理間都未達到顯著差異的水平；組織疏松度（SR）在CK處理下值最高，和其他處理都達到顯著差異的水平，T1處理的值最低，T2和T3處理差別不大，未達到顯著差異的水平；柵欄組織與海綿組織比（P/I）在不同溫度處理下也表現比較穩定，僅CK和T1處理間達到顯著差異的水平。

從以上研究結果可知，2個品種椰子的葉片總厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度都表現為和CK相比，T1和T2處理都較CK有較大幅度的下降，但T3處理反而比T1或T2處理的值有所上升，可能在T3處理下，葉片的結構發生變形，細胞扭曲，細胞間隙加大，尤其是海綿組織和柵欄組織的分界已經開始模糊不清有關，而且柵欄組織厚度和海綿組織厚度的變化不明顯，可能不宜作為低溫處理研究椰子解剖結構的變化。CTR和P/I的值相對比較穩定，SR值的變化相對較大。

3 討論與結論

研究不同低溫處理下植物耐寒相關指標的變化是研究植物抗寒能力、評價植物抗寒性的重要方法。通過研究布迪椰子、沼地棕和油棕3種棕櫚植物在低溫鍛煉前（10月份）和低溫鍛煉后（次年1月份）所采的葉片在不同低溫處理時的電解質滲透率變化趨勢不同，發現布迪椰子的耐寒力最強而且對降溫反應速度最快，沼地棕居中，油棕耐寒力最弱，對溫度反應最慢[12]；以伊麗莎白和玉金香2個甜瓜品種為材料，以正常自然溫度（25 ℃/18 ℃，12 h）為對照，研究了晝夜低溫（10 ℃/5 ℃，12 h）和夜間低溫（20 ℃/5 ℃，12 h）處理對甜瓜幼苗生長及根系生理指標的影響，結果表明，與對照相比，晝夜低溫和夜間低溫處理7 d均顯著抑制了甜瓜幼苗生長，玉金香比伊麗莎白對低溫更加敏感[13]；以杜竹屬清甜竹、花吊絲竹和勃氏甜龍竹的盆栽苗為實驗材料，測定了模擬低溫（0、-5、-10、-15、-20和-25 ℃和自然低溫（15、10、5、3、0和-2 ℃）條件下3個竹種葉片的形態變化以及相對電導率等抗寒相關指標的變化，認為3個竹種的抗寒性均較差，其中清甜竹的耐寒能力最弱[14]。本研究也是通過抗寒相關指標在低溫處理下的變化，評價不同椰子品種的抗寒能力，與上述的研究方法相類似。

而葉片形態解剖結構的變化是植物對低溫等環境適應的基礎，其結構的穩定性與其抗寒能力密切相關[15-16]。在本研究中，在T1、T2處理下，和CK相比，海南本地高種椰子和香水椰子的葉片總厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度都有所降低，但是僅有葉片總厚度在不同低溫處理下，差異表現較為明顯，可作為抗寒性的評價指標，而柵欄組織厚度、海綿組織厚度在不同溫度處理下變化幅度不如葉片總厚度大，尤其是海南本地高種椰子的柵欄組織厚度和海綿組織厚度在不同處理下變化差異不明顯，不宜作為抗寒評價的指標；上述3個指標的香水椰子降低的幅度比海南本地高種椰子的大，可能與香水椰子在低溫處理下結構變形較為明顯，抗寒性不如海南本地高種椰子強，這與以前的研究結果相類似[14-15]。但在T3處理下，葉片總厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度等反而比T2處理下有所增加，尤其是香水椰子增加的幅度較大，可能與T3處理的溫度太低，植株萎蔫直至嚴重脫水，細胞結構變形，柵欄組織與海綿組織難以準確的區分有關[17-18]。

在利用葉片解剖結構評價植物的抗寒性時，單一的葉片結構參數受環境影響大，不能反映植物的抗寒能力，所以通常采用葉片細胞結構緊密度（CTR）和疏松度（SR）作為評價抗寒能力的指標，通過對一些植物葉片組織解剖結構的研究發現，品種的抗寒性與葉片組織結構緊密度呈正相關，與組織疏松度呈負相關[19-21]。但有的研究認為SR和CTR等指標與抗寒性關系不大[22-24]，本研究中也得出類似的結果，CTR、SR和P/I的值在低溫處理的過程中變化幅度較小，不宜作為抗寒評價的指標。

通過對2個椰子品種葉片解剖結構在低溫處理下的變化研究，認為葉片總厚度在2個椰子品種的不同低溫處理下都變化明顯，可作為椰子抗寒種質鑒定時的結構指標進行運用。香水椰子在CK處理下（最低溫度18 ℃），有輕度受害的現象出現；T1（最低溫度16 ℃）和T2（最低溫度12 ℃）對其傷害比較大，葉片變褐﹑結構變形，葉片總厚度等結構指標的值降低幅度較大；T3（最低溫度8 ℃）處理下受到嚴重脅迫傷害，結構嚴重變形，海綿組織和柵欄組織混淆，葉片總厚度等結構指標的數值反而有所上升。而海南本地高種椰子在CK處理下生長正常，T1處理對其結構變化影響不大，T2和T3處理下仍能保持相對完整的葉片形態，葉片總厚度等結構指標在每個處理下的變化幅度小于香水椰子結構指標的變化幅度，表明海南本地高種椰子的抗寒性強于香水椰子。

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