芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性測定

蒲金基 張賀 楊石有 楊慧杰 劉曉妹

摘 要 采用生長速率法測定了采自中國芒果主產區、泰國、夏威夷等地的127個芒果炭疽菌對甲基硫菌靈的敏感性。結果表明，芒果炭疽菌株對甲基硫菌靈的EC50值范圍為0.005 7～7.850 5 μg/mL，最大EC50值是最小EC50值的1 377倍。不同地區、不同染病部位、不同年份的芒果炭疽菌株對甲基硫菌靈的敏感性不同，采自四川菌株敏感性最低，采自夏威夷菌株敏感性最高；不同分離部位敏感性程度依次為枝、果、葉；2011～2013年，菌株敏感性逐年降低，存在很大的抗藥性風險。

關鍵詞 芒果；炭疽病菌；甲基硫菌靈；敏感性

中圖分類號 S481 文獻標識碼 A

芒果炭疽病是芒果生產上發生最普遍、危害最嚴重的一種病害，在世界芒果種植區內均有發生[1]，也是貯藏期最主要病害之一，已成為芒果產業健康發展的限制性因素之一[2]，其病原菌主要以膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.& Sacc.]為主。該病主要為害芒果葉片、嫩梢、花序和果實，可造成植株葉枯、梢枯、落花落果和采后果實大量腐爛[3]。病原菌寄主范圍極為廣泛，除為害芒果外，絕大多數熱帶亞熱帶果樹均是其重要寄主[4]。

甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）又名甲基托布津，由日本曹達株式會社研制開發的一種廣譜內吸性低毒殺菌劑，能防治多種真菌病害，具有內吸、預防和治療作用。甲基硫菌靈與苯菌靈、噻菌靈等苯并咪唑類殺菌劑，是目前生產上防治芒果炭疽病采用的主要殺菌劑[5]。甲基硫菌靈被植物吸收后即轉化為多菌靈，主要干擾病原菌菌絲的形成，影響病原菌細胞分裂，孢子萌發長出畸形芽管，從而抑制或殺死病原菌[6]。由于該類藥劑作用靶標專一，長期單一使用很容易產生抗藥性而導致防效下降或喪失，殺菌劑抗藥性行動委員會（FRAC）將其歸為高風險類[7]。葉佳等[8]對浙江省杭州、嵊州和嘉興3地78個葡萄炭疽菌（C. gloeosporioides）抗藥性研究發現，其抗性頻率為51.3%；陳聃等[9]通過對浙江省108株葡萄炭疽菌對甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性研究發現已有37.04%的菌株對甲基硫菌靈產生了抗藥性；陳新建等[10]研究發現蘆筍莖枯病菌（Phompsis asparagi）已經對甲基硫菌靈產生嚴重抗藥性；楊煒華等[11]研究發現蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp. piricola）對甲基硫菌靈已經產生了中度的抗藥性。Spalding[12]報道了C. gloeosporioides對苯菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈存在正交互抗性；此外，在南非、印度等國報道了芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑產生了抗藥性[13-15]。

近年來的田間觀測發現，甲基硫菌靈在芒果園內的防治效果有所降低，這可能是敏感性降低或抗藥性的緣故，但尚缺乏大量試驗數據證實。為全面探討芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性問題，本研究從中國芒果主產區、美國夏威夷州和泰國等地采集、鑒定127個菌株，開展其對甲基硫菌靈的敏感性測定，繪制敏感性頻率分布圖，為病害的科學防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2005年～2013年從海南、廣東、廣西、云南、四川以及泰國和美國夏威夷州等芒果產區采集感病的葉、莖和果等樣品，包括貴妃芒、青黃芒、金煌芒、象牙芒、臺農1號芒、紅芒、紫花芒、凱特芒、呂宋芒、粵西2號、澳芒R2E2、玉文芒、蛋芒和三年芒等14個品種。所有樣品經組織分離、單孢純化、鑒定后接種于PDA試管斜面培養基上，低溫保存備用。累計獲得單孢菌株127株，其中海南60株，廣東12株，廣西16株，四川9株，云南16株，泰國9株，美國夏威夷州5株。

1.1.2 供試藥劑 96%甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）原藥（江蘇龍燈化學有限公司），丙酮（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養基制備 準確稱取0.052 1 g 質量分數為96%甲基硫菌靈原藥，加入250 mL容量瓶中，用丙酮溶解配成有效成分的質量濃度為200 μg/mL的甲基硫菌靈母液。采用系列濃度稀釋法配成不同質量濃度的藥劑，用移液槍分別移取不同系列濃度的藥劑5 mL加入到冷卻至50 ℃左右195 mL的PDA培養基中，充分混合均勻，制成實驗所需的含藥培養基平板。每處理濃度重復3次，以不加藥劑而含等量丙酮的PDA培養基為對照。

1.2.2 芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈敏感性測定

采用菌絲生長速率法[16]。各實驗菌株在PDA平板培養好后，用無菌打孔器取d=5 mm的菌餅，移至含不同甲基硫菌靈質量濃度的平板上，每濃度重復3次，28 ℃下黑暗培養4 d后用十字交叉法測量菌落直徑，以濃度對數（x）為橫軸與抑制菌落生長百分率的機率值（y）為縱軸求甲基硫菌靈對病原菌的毒力回歸方程y=ax+b，并計算抑制菌體生長的有效中濃度EC50值及R2。抑制率公式如下[17-18]。

抑制率=×100%

2 結果與分析

2.1 芒果炭疽病菌菌株對甲基硫菌靈敏感性測定結果

127株供試菌株對甲基硫菌靈的敏感性測定結果表明：芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性存在明顯的差異；EC50值介于0.005 7～7.850 5 μg/mL之間，平均值為0.878 9 μg/mL，EC50值高于平均值的菌株有33個，占總數的25.98%。菌株Mcg-265（四川省攀枝花市）的EC50 值最大（7.850 5 μg/mL），菌株Mcg-265（海南省樂東縣）的EC50 值次之（7.666 6 μg/mL），2者均>7.0 μg/mL；菌株Mcg-112（海南省三亞市）的EC50值最小（0.005 7 μg/mL），最大EC50值是最小值的1 377倍、平均值的9.3倍。供試菌株中已有部分菌株敏感性開始降低，尚未上升為優勢群體（圖1）。本研究結果所測定得到的平均值可作為芒果炭疽菌的敏感性基線，為后續的抗藥性監測與治理提供參考。

2.2 不同地區芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性水平

不同地區的127個菌株對甲基硫菌靈的敏感性測定結果表明：不同地區的芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性存在明顯差異；海南菌株EC50值為0.005 7～7.666 6 μg/mL、均值為0.920 2 μg/mL，菌株之間差異最大；四川菌株EC50值為0.341 8～7.850 5 μg/mL、均值最大，菌株之間的差異相對略小；廣西菌株EC50值為0.010 9～0.902 2 μg/mL、均值較小，菌株之間的差異中等；不同地區菌株的EC50最大值和最小值同樣存在較大差異，海南省的菌株EC50最大值是最小值的1 345倍，泰國的菌株為391倍，而其他地區的差異則在23～84倍（表1）。

2.3 不同染病部位菌株對甲基硫菌靈的敏感性比較

通過對比3個不同分離部位的芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性結果表明：不同分離部位的菌株對甲基硫菌靈的敏感性也存在差異，其中從葉片上分離的菌株對甲基硫菌靈的EC50值為0.005 7～7.850 5 μg/mL、 均值最大（0.914 7 μg/mL），表明分離自葉片的分布范圍最廣，菌株之間的差異最大；從枝條上分離的菌株對甲基硫菌靈的EC50值為0.013 6～1.285 9 μg/mL、均值最小（0.595 3 μg/mL），表明分離自枝條的EC50值范圍與差異程度均低于葉片；不同分離部位的敏感性程度由高到低依次為枝、果、葉（表2）。

2.4 連續3年菌株對甲基硫菌靈的敏感性比較

對比2011～2013年連續3年在國內芒果主產區所采集的菌株對甲基硫菌靈的敏感性發現，供試菌株不同年份的敏感性有所不同，呈下降趨勢；EC50均值逐年增高，2012年和2013年分別增加12.37%、25.11%（表3）。表明芒果炭疽病菌的抗藥性風險在逐年增加。

3 討論與結論

利用化學農藥防治植物病害是植物病害綜合防治措施之一，具有見效快、防病效果好等優點，但如果長期施用單一殺菌劑，則易使病原菌產生抗藥性[19]。生產上常用苯菌靈、多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑來防治芒果炭疽病，隨著使用年限和用量的增加，芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）逐漸對該類藥劑產生了不同程度的抗藥性。

本研究通過127株芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性測定發現，病原菌對甲基硫菌靈的敏感性存在明顯差異，不同采集地區、分離部位和菌株收集年份的敏感性差異明顯。不同地區菌株之間的差異以海南最大，泰國其次，但均高于美國夏威夷州的菌株。泰國是芒果的重要發源地之一，具有悠久的種植歷史，其田間芒果炭疽病防治主要依靠化學藥劑，從而導致其病原菌對甲基硫菌靈的敏感性差異較大，EC50均值較高，與中國芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性情況較為類似。而美國夏威夷州由太平洋中的夏威夷群島組成，離芒果主栽區的距離較遠，使用殺菌劑的頻次較低，甚至不使用殺菌劑，這與該地菌株的敏感性較高有一定的相關性。從而說明菌株對藥劑的敏感性與不同地區的用藥水平和施藥次數有關，也可能是不同藥劑的長期施用或混用，造成了藥劑之間的交互抗性或負交互抗性[20]；或者與芒果炭疽病菌的遺傳分化有關，而關于遺傳分化與抗藥性之間的關系有必要進一步深入研究。

通過比較不同分離部位菌株對甲基硫菌靈的敏感性發現，分離自葉片的菌株能夠代表供試菌株整體情況，在開展抗藥性監測和治理過程中，為便于獲得病原菌，可以采集染病葉片，從而確保監測與治理工作的周年實施。

比較2011～2013年所采集的菌株對甲基硫菌靈敏感性的研究結果發現，供試菌株對藥劑的敏感性有所下降，EC50均值增長幅度超過10%，其抗藥性風險逐年增加，其原因可能是病原菌對甲基硫菌靈所產生的抗藥性或因苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性所致，此需進一步深入研究。

127株菌株中，74.02%菌株的EC50值<平均值0.878 9 μg/mL，而25.98%菌株的EC50值高于平均值，這與葉佳等[8-9]等研究葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）對甲基硫菌靈的結果相似。Kumar等[14]報道分離自印度的芒果炭疽病菌中Cg3菌株對甲基硫菌靈表現了中度抗藥性；Sanders等[15]研究南非芒果炭疽病菌對苯并咪唑類的噻菌靈和苯菌靈抗藥性發現，8.5%、9.2%菌株分別對噻菌靈或苯菌靈產生中度抗藥性，這些研究結果都說明了芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性逐漸降低，有產生抗藥性的趨勢。

為減緩芒果炭疽病菌對甲基硫菌靈抗藥性的產生，生產上應高度重視其抗藥性問題，避免長期單一施用苯并咪唑類藥劑，推薦輪換或混合用藥，加強抗藥性檢測與治理。芒果炭疽病菌的抗藥性問題是一個極其復雜的綜合性問題，本研究只進行了室內敏感性測定，仍需對敏感度低的菌株開展遺傳穩定性、紫外誘導抗藥性以及抗藥性分子機制等方面進行研究。

參考文獻

[1] 林智泉. 芒果病蟲害及其綜合防治[J]. 果農之友， 2006（10）；35.

[2] 戚佩坤. 果蔬貯運病害[M]. 北京： 中國農業出版社， 1994： 91-93.

[3] 楊 葉， 何書海， 張淑娟，等. 海南芒果炭疽菌對多菌靈的抗藥性測定[J]. 熱帶作物學報， 2008， 29（1）： 73-77.

[4] 戚佩坤. 廣東果樹真菌病害志[M]. 北京：中國農業出版社，2000： 6-16.

[5] 詹儒林， 李 偉， 鄭服叢. 芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性[J]. 植物保護學報， 2005， 32（1）： 71-76.

[6] 楊 謙. 植物病原菌抗藥性分子生物學[M]. 北京： 科學出版社，2011：33-37.

[7] Fungicide resistance： the assessment of risk[EB/OL]. [2014-04-11]. http：//www.frac.info/publication/anhang/FRAC_Mono2_2007.pdf.

[8] 葉 佳， 張傳清. 葡萄炭疽病菌對甲基硫菌靈、戊唑醇和醚菌酯的敏感性檢測. 農藥學學報， 2012， 14（1）： 111-114.

[9] 陳 聃， 時浩杰， 吳慧明， 等. 浙江省葡萄炭疽菌對甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性研究[J]. 果樹學報， 2013， 30（4）： 665-668.

[10] 陳新建，葉鐘音. 蘆筍莖枯病菌對甲基托布津的抗藥性初步研究[J]. 南京農業大學學報， 1998， 22（1）： 29-32.

[11] 楊煒華， 劉開啟. 蘋果輪紋病菌對多菌靈、甲基硫菌靈的抗藥性測定[J]. 植物保護學報， 2002， 29（2）： 191-192.

[12] Spalding D H. Resistance of mango pathogens to fungicides used to control postharvest diseases[J]. P1ant Disease， 1982， 66： 1 185-1 186.

[13] Eckert J W. Recent developments in the chemical control of postharvest diseases[J]. Acta Horticulturae， 1990， 269： 477-494.

[14] Kumar A S， Reddy N P E， Reddy K H， et al. Evaluation of fungicidal resistance among Colletotrichum gloeosporioides isolates causing mango anthracnose in Agri Export Zone of Andhra Pradesh， India[J]. Plant Pathology Bulletion， 2007， 16（3）： 157-160.

[15] Sanders G M， Korsten L， Wehner F C. Survey of fungicide sensitivity in Colletotrichum gloeosporioides form different avocado and mango production areas in South Africa[J]. European Journal of plant pathology， 2000， 106（8）： 745-752.

[16]黃彰欣. 植物化學保護實驗指導[M]. 北京：中國農業出版社，1993： 56-59.

[17] 孟昭禮， 羅 蘭， 袁忠林，等. 人工模擬的植物源殺菌劑銀泰防治番茄3種病害效果研究[J]. 中國農業科學， 2002， 35（7）：863-866.

[18] 于平儒， 卲紅軍， 馮俊濤，等. 62種植物樣品對菌絲活性的測定[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版）， 2005（1）： 71-76.

[19] 李曉軍， 范 昆， 曲健祿，等. 蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性測定[J]. 果樹學報， 2009， 26（4）： 516-519.

[20] 張令宏， 李 敏， 高兆銀，等. 抗多菌靈的芒果炭疽病菌的殺菌劑篩選及其交互抗性測定[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（3）：347-352.

責任編輯：古小玲