電子鼻在芒果采后病原菌種類判別中的應用研究

李敏 胡美姣 張正科 梁秋南 楊冬平 陳亮 鄭淑英 高兆銀

摘 要 利用電子鼻對膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果擬莖點霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）4種芒果采后病害病原菌發酵液的揮發性氣味進行檢測，以評估電子鼻用于芒果不同真菌病原菌種類判別的可行性。結果表明，對氣味響應值進行的主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）及聚類分析均能夠正確區分不同病原菌種類。多因素方差分析（MANOVA）結果顯示，不同病原菌之間的差異顯著（p<0.05）。結果為芒果采后病原菌種類判別提供新的方法，為其他病原菌的種類判別提供參考。

關鍵詞 芒果；電子鼻；病原菌；主成分分析；線性判別分析；聚類分析；多因素方差分析

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

通常病原真菌的種類鑒定以觀察其形態學特征為主，另外可通過病菌rDNA-ITS序列對比分析做進一步驗證。然而利用形態學進行種類判斷時，常出現因培養條件不適合或培養時間短，造成病菌產孢結構和孢子缺失現象，給鑒定工作帶來一定的困難和限制。利用對比rDNA-ITS序列等分子生物學手段進行輔助驗證也需要一定周期。然而有研究發現，真菌可以釋放出多種揮發性有機化合物（VOC）[1-2]，GC-MS分析表明其包含如單萜，倍半萜，醇類、醛、芳香族化合物，碳氫化合物，酯，酮，呋喃，氮和含硫化合物等[3-5]。而電子鼻可以分析、識別和檢測復雜嗅味及大多數揮發性成份。其通常由若干氣敏傳感器組成傳感器陣列進行氣體揮發性物質的復合檢測和識別，陣列中每一個傳感器對某些特定種類的氣體成分敏感，使得整個電子鼻能夠對氣體中不同的成分進行識別并給出總體評價。目前已廣泛用于農畜產品的品質檢測和分級。在水果成熟度監控、貨架期判斷、水果種類鑒定等方面均有一定的應用價值[6-8]。有研究結果表明，電子鼻技術能夠對藍莓[9]和草莓[10]是否早期感染病害做出較準確的判斷。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果擬莖點霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）[11]是芒果采后病害主要病原菌，本研究擬以芒果采后病害主要病原菌為研究對象，應用電子鼻測定這4種病原菌發酵液的氣味響應值，通過主成分分析、線性判別式分析等方法探討基于電子鼻區分不同芒果采后病原菌的可行性，為芒果采后病原菌種類判斷提供有效的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 病原菌

芒果采后常見4種病原真菌：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.，CG）（3株菌株，編號分別為CG1、CG2、CG3）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.，BT）（3株菌株，編號BT1、BT2、BT3）、芒果小穴殼（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.，DD）（3株菌株，編號DD1、DD2、DD3）和芒果擬莖點霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.，PM）（3株菌株，編號PM1、PM2、PM3），均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所采后病害及貯運保鮮實驗室分離、鑒定、保存。

1.2 傳感器響應值測定

將12株菌株分別置于PDA培養基28 ℃培養 5 d后，取6塊病菌菌餅（Φ=5 mm）接種到含100 mL PDB培養基的三角瓶中，置于28 ℃，150 r/min振蕩培養3 d。再應用德國AIRSENSE公司PEN3便攜式電子鼻獲取菌株發酵液氣味的響應值。電子鼻傳感器陣列包含10個傳感器（見表1）。測定時，傳感器涂層吸附樣品中的揮發性物質產生電導率變化，記錄傳感器吸附樣品揮發物后的電導率G與傳感器吸附經活性碳過濾的空氣后的電導率G0的比值G/G0（即相對電導率），響應氣體濃度越大，G/G0的值越偏離1，如果濃度低于檢測限或者沒有感應氣體，則該比值接近甚至等于1。

1.3 傳感器響應值數據處理

采用電子鼻自帶的 Winmuster 軟件進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、載荷分析（loading Analysis）。利用軟件SPSS進行多因素方差分析、聚類分析。

2 結果與分析

2.1 主成分分析（PCA）

利用48、49、50 s時的響應值進行主成分分析（PCA），結果表明，第一主成分（PC1）區分貢獻率為98.98%，區分貢獻率大于90%，表明第一主成分已經基本代表了樣品的主要信息特征（圖1）。第二主成分（PC2）區分貢獻率僅為0.63%，但在區分不同病菌種類中起重要作用。通過PCA分析發現，相同的病原菌分別聚在相近的位置，從而可以將4種病原菌較好的區分開來。其中B. theobromae和其它3種病菌的距離最遠，且3株B. theobromae的距離也相對較大。C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae在第一主成分上差異較小，三者之間的區別主要體現在第二主成分上。

2.2 線性判別（LDA）分析

利用傳感器第48、49、50 s時的響應值進行線性判別式（LDA）分析，結果表明， 第一判別式（LD1）的貢獻率為98.95%，大于90%，已經基本代表了樣品的主要信息特征（圖2）。第二判別式（LD2）的貢獻率僅為0.83%，但在區分不同病菌種類中起關鍵作用。利用線性判別式分析，可以將BT、CG、DD、PM這4種不同的病原菌很好的區分開，相同的病原菌分別落在相近的位置（圖1，2），B. theobromae和其它3種病菌的區別較大，而C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae的區別主要體現于第二判別式。

2.3 載荷（loading）分析

通過載荷分析，可以得出電子鼻的10個傳感器分別對樣品的PCA主成分分析的貢獻率。其中S7號傳感器對第一主成分區分和第二主成分區分貢獻率最大。S2、S6、S8、S9號傳感器對第一主成分貢獻率較大；S2、S7、S8號3個傳感器對應的點在第一象限中距離很近，說明這3個傳感器的響應值并不是菌株揮發性氣體的特征信號，S1、S3、S4、S5、S10這5個傳感器對第一主成分區分和第二主成分區分貢獻率均很小（圖3）。

2.4 響應值方差分析

利用病原菌對電子鼻傳感器第50 s的響應值進行多因素方差分析，結果如表2所示。其中 Wilks'Lambda表示組內變異與總變異的比值，在0～1之間； Wilks' Lambda值越接近1，表示各個組間的差異越?。籛ilks'Lambda越接近0，表示組間差異越大。由表2可知，4種病原菌間響應值的Wilks'Lambda均接近0，說明不同病菌間有明顯差異，差異水平顯著（p<0.05）。

2.5 不同病原菌響應值的聚類分析

利用12株病原真菌對電子鼻傳感器第50s的特征響應值，按照系統聚類的歐氏距離ward法進行系統聚類，結果表明（圖4），同種的3株病原真菌分別聚成一類。不同病原菌之間關系有差別。其中C. gloeosporioides和D. dominicana的距離最近，其次是P. mangiferae；B. theobromae與其它3種病原菌的距離較遠。

3 討論與結論

真菌可以釋放出多種揮發性物質[1-2]，但揮發物的氣味特征和種類之間是否有相關性、是否能根據氣味特征進行種類的識別等尚未見報道。本文利用電子鼻對不同芒果4種病原真菌發酵液進行氣味的測定，并對10組傳感器的響應值進行了PCA分析、LDA分析、方差分析和聚類分析，每種分析結果均可把同種病原菌的3株菌株劃為一組，從而較好區別不同的病原菌，初步證明同種病菌的發酵液具有相似的揮發性氣味，且有區別于其他病菌。聚類分析的結果表明，C. gloeosporioides和D. dominicana的距離最近，說明其發酵液氣味較相近，B. theobromae與其它病原菌的氣味差異較大。筆者利用Genebank上rDNA-ITS序列構建4種病原菌系統進化樹的聚類結果表明，C. gloeosporioides和P.mangiferae關系較近，而B. theobromae和D. dominicana的關系較近。該結果與電子鼻傳感器響應值的聚類結果有很大差異。說明供試病菌的氣味差異與其親緣關系的親疏沒有相關性。

朱娜等[10]利用電子鼻特征傳感器響應值，構建了草莓感染3種霉菌類型的判別模型，判別準確率達 95%以上。本研究中由于沒有足夠的實驗樣本量，無法運用Fisher 線性判別分析等方法構建判別模型，在后期研究中，增加每種病菌的實驗樣本量，建立準確的病菌類型判別數學模型，從而實現利用電子鼻進行4種芒果采后病害種類的準確區分和判別。為芒果采后病原菌種類的判斷提供有效的輔助手段。

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