番石榴多酚成分分析及抑菌活性研究

黃和 林曉霞 鄺高波 曹湛慧

摘 要 采用UPLC-MS/MS法對番石榴多酚中部分酚類物質進行了定性分析。以抑菌圈直徑為評價指標，測定了番石榴多酚的抑菌活性，并以金黃色葡萄球菌為指示菌，對其抑菌穩定性進行了研究。結果表明：番石榴多酚中含有沒食子酸、兒茶素、槲皮素、原兒茶酸、山奈素和綠原酸等酚類物質。番石榴多酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制效果，除了單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH4～5范圍內處理后抑菌活性最強，其抑菌活性對溫度、紫外照射具有穩定性，低鹽度會促進其抑菌活性。

關鍵詞 番石榴多酚；酚類物質分析；抑菌活性

中圖分類號 TS255.1 文獻標識碼 A

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科番石榴屬，嗜熱畏寒，為亞熱帶水果，在我國廣東、廣西、福建均有種植，其味清香可口，含有豐富的營養物質[1]。微生物是引起食物腐敗的一個重要因素，不僅降低食物感官品質、營養價值，產生的毒素更會危害人體健康。在食品工業領域，防止食物腐敗的方法有冷藏、殺菌、密封包裝、添加防腐劑等，以延長產品的貨架期[2-4]。防腐劑分為化學合成防腐劑和天然活性防腐劑，合成防腐劑價格低廉、效果顯著，但具有潛在的安全問題，因此天然防腐劑的研究受到越來越廣泛的重視。植物多酚類物質具有抑菌活性，據報道蘋果多酚對細菌具有較強的抑制作用[5]，葡萄多酚對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、大腸埃希氏桿菌等具有抑制作用[6]，而番石榴果肉多酚的抑菌活性在國內外并無系統的研究。本研究采用牛津杯法測定了番石榴多酚的抑菌活性，并同時測定了其抑菌穩定性，旨為天然防腐劑提供另一種可行性選擇。目前關于番石榴多酚的成分鑒定及定量研究尚屬空白，而且多酚類物質種類繁多，有待進一步對其化學成分進行鑒定。本文運用HPLC和UPLC-MS/MS測定了番石榴多酚中的部分酚類物質，可為其進一步化學成分鑒定提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番石榴購于湛江沃爾瑪超市，產地湛江；大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli，G-），金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus，G+），副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，G-），單增李斯特菌（Listeria spp，G+），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，G-），腐敗希瓦氏菌（Hewanella putrefacens，G-），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+）取自廣東海洋大學食品科技學院微生物實驗室；營養瓊脂培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司；山梨酸鉀（化學純）出自中國醫藥上海化學試劑公司；色譜純甲醇出自天津市協和昊鵬色譜科技有限公司；乙酸為廣東光華化學廠有限公司；槲皮素，沒食子酸，兒茶素，綠原酸，阿魏酸，咖啡酸，原兒茶酸來自中國食品藥品檢定研究院；山奈素，根皮苷購于北京金寶在線科技有限公司，試劑都為色譜純級。

超凈工作臺（潔凈等級100級）出自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SPX-250-Z型生化培養箱出自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BL-620S電子天平出自日本Shimadzu公司；YX-280 型手提式壓力蒸汽消毒器出自江陰濱江醫療設備廠；TSQ Quantum Access液質聯用儀（ESI）出自美國Thermo公司；色譜柱為UPLC ACQUITY BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm；

1.2 方法

1.2.1 番石榴多酚組分的分離及分析 番石榴多酚的制備：微波輔助法提取番石榴多酚[7]，粗提物旋轉蒸發濃縮備用。采用NKA-9大孔吸附樹脂純化番石榴多酚[8]，然后用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠進一步分離[9]，得到4個不同組分：GP1、GP2、GP3和GP4。

UPLC-MS測定番石榴多酚組分：將Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離番石榴多酚后得到的4個組分用色譜純甲醇定容至1 μg/mL，槲皮素、沒食子酸、兒茶素等標品用少量色譜純甲醇濕潤后，配制成1 mg/mL母液，取各自母液1 mL定容至1 μg/mL，得到標準液，4 ℃保存備用。采用UPLC-MS對番石榴多酚分離組分GP1、GP2、GP3和GP4中部分簡單酚類成分進行測定，條件如下：

流動相：乙腈（A）/0.1甲酸水溶液（V ∶ V）；梯度洗脫程序為：0～1 min，20% A；1～3 min，20%～50% A；3～4 min，90% A保持1 min。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；

進樣量：10 μL；離子源：ESI，負離子模式；毛細管電壓：4.0 kV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；錐孔電壓：40 V；掃描方式：多反應監測（MRM）。

1.2.2 番石榴多酚抑菌活性測定 菌懸液的制備：將供試菌株劃線于無菌營養瓊脂斜面后于37 ℃下培養24～36 h，在無菌條件下向已活化好的供試菌株瓊脂斜面中加入10 mL無菌生理鹽水，輕輕刮松菌苔，渦旋振蕩器振蕩混勻，用無菌生理鹽水進行10倍稀釋，制成初始稀釋菌懸液，濃度為106～107 cfu/mL，備用。

抑菌活性定性試驗：稱取6 g素瓊脂于300 mL蒸餾水中加熱溶解，分裝于3個250 mL三角瓶中高壓滅菌，冷卻至50 ℃左右時，在超凈工作臺上倒入無菌培養皿中，每個培養皿約5 mL，水平放置，讓其均勻鋪滿培養皿底部，凝固后在平板上均勻擺放4個無菌牛津杯（外徑8 mm，內徑6 mm）備用。

取營養瓊脂33 g于1 L水中加熱完全溶解，分裝在100 mL三角瓶中滅菌，待培養基冷卻至50 ℃左右時，取2 mL各菌懸液分別加入培養基中搖勻，趁熱將沒凝固的含菌營養瓊脂培養基傾入擺放了牛津杯的素瓊脂平板上層，每個平板約10 mL，水平放置均勻鋪滿平板，待凝固后取下牛津杯，向含不同測試菌平板的牛津杯孔中分別加入前面制備好的80 μL 10、5、2 mg/mL的番石榴多酚溶液，以無菌水為對照，細菌于37 ℃左右培養24 h，真菌培養48 h后觀察有無抑菌圈，游標卡尺測定抑菌圈大小（測定抑菌透明圈的直徑），平行試驗3次，以無菌水溶液為空白對照。

最低抑菌濃度（MIC）的測定：采用二倍稀釋法將番石榴多酚溶液稀釋成濃度50、25、12.5、6.25、3.125 mg/ml的梯度溶液，滅菌后分別取1 mL加入9 mL含有各測試菌的融化營養瓊脂中混勻，使其濃度為5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL，倒平板在37 ℃左右培養24 h，觀察菌體生長情況，以確定作為最低抑菌濃度，以山梨酸鉀溶液作為陽性對照，無菌水測試菌作為空白對照，平行3次。

pH值對番石榴多酚的抑菌效果：配制pH分別為2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9的5 mg/mL的番石榴多酚溶液，處理適當時間后，將pH重新調回至中性，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗方法測定不同pH處理番石榴多酚后對抑菌效果影響，平行試驗3次。

番石榴多酚抑菌活性的熱穩定性試驗：將5 mg/mL的番石榴多酚溶液分別于60、70、80、90 ℃水浴以及于121 ℃加熱20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗方法分別測定不同溫度處理后的番石榴多酚的抑菌效果，以測定番石榴多酚抑菌活性的熱穩定性，平行試驗3次。

鹽對番石榴多酚抑菌效果的影響：5 mg/mL的番石榴多酚溶液配制成分別含有0.1%、0.3%、0.6%、0.9%氯化鈉的待試液，以含同等濃度氯化鈉的無菌水作為空白對照組，金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗方法測定無機鹽對抑菌效果的影響。

紫外輻射對番石榴多酚抑菌活性的影響：將5 mg/mL番石榴多酚溶液放置于超凈工作臺上紫外照射0、10、20、30、40、50、60 min，以無菌水溶液為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，按前述抑菌活性定性試驗方法測定紫外照射對番石榴多酚抑菌穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 UPLC-MS測定番石榴多酚

標準品UPLC-MS/MS色譜圖和質譜參數分別見圖1和表1。根據上述UPLC-MS/MS條件以及離子碎片信息，對番石榴多酚進行定性測定，結果見表2。番石榴多酚經葡聚糖凝膠純化得到的4個組分中均含有山奈素，兒茶素，沒食子酸，原兒茶酸，GP1中沒食子酸含量最高（69.4 mg/kg），其次是兒茶素（23.99 mg/kg），山奈素含量最低，綠原酸為其特有成分；GP2中沒食子酸含量為529.74 mg/kg，在4個組分中含量最高；GP3中兒茶素（2 191.49 mg/kg）含量最多，均高于其它組分，但山奈素含量低于另外3個組分（0.25 mg/kg）；槲皮素是GP4中特有成分，含量為32.38 mg/kg。

2.2 抑菌活性定性試驗

番石榴多酚抑菌效果的定性試驗結果見表3。根據表中各成分對供試菌種的抑菌圈大小，可以看出番石榴多酚具有一定的抑菌活性，具有較為廣泛的抑菌譜。在試驗濃度內，對受試菌種大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌都具有抑制活性，對副溶血弧菌沒有抑制活性。番石榴多酚的濃度和抑菌圈大小具有劑量關系，濃度越大抑制效果越明顯，當濃度降至2 mg/mL時，只對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌具有抑制作用，空白對照組沒有觀察到抑菌圈。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

番石榴多酚對各供試菌的最低抑菌濃度見表4。銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC低于1.25 mg/mL，大腸桿菌的MIC低于2.5 mg/mL，單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL，番石榴多酚對單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的抑制活性低于其他幾種供試菌。防腐劑山梨酸鉀對單增李斯特菌的MIC低于5 mg/mL，其余的都低于2.5 mg/mL，番石榴多酚對供試菌的抑菌活性和對照品防腐劑的抑菌活性相當，甚至略優于山梨酸鉀，說明番石榴多酚具有成為新型天然活性防腐劑的潛力。

2.4 不同pH值對番石榴多酚的抑菌效果的影響

以金黃色葡萄球菌為指示菌，不同pH處理后的番石榴多酚的抑菌效果如圖2。酸性條件處理后番石榴多酚的抑菌效果比在堿性條件處理后強，在pH4～5范圍內處理后抑菌活性最高，pH超過8以后，抑菌效果急速下降。分析這是因為多酚類物質自然情況下屬于酸性物質，在堿性環境中結構會遭到破壞而引起抑菌效果的減弱，總體上看番石榴多酚在較廣的pH范圍內抑菌效果較好。

2.5 番石榴多酚抑菌活性的熱穩定性試驗

番石榴多酚抑菌活性的熱穩定性效果見圖3。在60～121 ℃范圍內，抑菌圈直徑波動很小（p>0.05），其抑菌熱穩定性較好，適合添加在需熱處理的食品中作為天然防腐劑。

2.6 鹽濃度對番石榴多酚抑菌效果的影響

低濃度鹽對番石榴多酚抑菌效果影響見圖4。鹽對番石榴多酚的抑菌效果具有一定的促進作用，在試驗濃度范圍內，濃度越高，抑菌圈直徑越大，而相同鹽濃度的各對照組均沒有觀察到明顯的抑菌圈，說明抑菌活性的增加不太可能是滲透壓增高而引起的，具體原因有待進一步研究。

2.7 紫外輻射對番石榴多酚抑菌活性的影響

紫外輻射對番石榴多酚抑菌活性影響見圖5。從圖5可以得出，在試驗條件內番石榴多酚對金黃色葡萄球菌的抑制活性不受紫外照射的影響（p>0.05），這個條件下番石榴多酚結構穩定，這可能是因為番石榴多酚本身具有苯環結構，在紫外區具有強吸收峰，結構的穩定不至于受影響，從而保證了抑菌活性的穩定[10]。

3 討論與結論

通過HPLC和UPLC-MS/MS對番石榴多酚中酚類成分進行定性和定量分析，發現其中含有沒食子酸、槲皮素、山奈素、兒茶素、原兒茶酸和綠原酸等酚類物質。其另外成分需繼續鑒定。

番石榴多酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制效果，除了單增李斯特菌和腐敗希瓦氏菌的MIC低于5 mg/mL外，其余均低于2.5 mg/mL。番石榴多酚在pH為4～5范圍內的抑菌活性最強，其抑菌活性對溫度、紫外照射具有穩定性，低鹽度會促進其抑菌活性。

植物多酚的抑菌機理目前并不明確，大量研究表明可能是通過以下途徑來達到抑菌效果[11]：植物多酚與細菌蛋白質結合；抑制細菌酶的合成；結合微生物生長必需物，造成微生物死亡；多酚的鄰苯二酚結構賦予其良好的金屬離子結合能力，與鐵離子結合而破壞微生物新陳代謝。與蘋果多酚、葡萄多酚等其他植物多酚的抑菌活性[5-6]相比，番石榴多酚也具有較好的抑菌活性，可作為天然防腐劑使用，并且原料價格便宜，來源容易。但是作為一種復合物，其具體是番石榴多酚中的哪幾種成分具有抑菌活性，以及具體抑菌機理有待進一步研究。

參考文獻

[1] 劉建林， 夏明忠， 袁 穎. 番石榴的綜合利用現狀及發展前景[J]. 中國林副特產， 2005（6）： 60-62.

[2] 張秀云. 天然防腐劑綜述[J]. 飲料工業， 2001， 4（4）： 1-5.

[3] 王 琳， 徐金瑞. 天然食品防腐保鮮劑的發展現狀及前景[J]. 塔里木大學學報， 2007， 19（1）： 73-78.

[4] 羅家剛. 天然食品防腐劑的研究進展[J]. 昭通師范高等專科學校學報， 2002， 24（10）： 39-45.

[5] 戚向陽， 陳福生， 陳維軍， 等. 蘋果多酚抑菌作用的研究[J]. 食品科學， 2003， 24（5）： 33-36

[6] 李建慧， 馬會勤， 陳尚武. 葡萄多酚抑菌效果的研究[J]. 中國食品學報， 2008， 8（2）： 100-107.

[7] 鄺高波， 黃 和. 微波輔助提取番石榴多酚的研究[J]. 食品工業科技， 2013， 34（24）： 288-291.

[8] 曹增梅， 黃 和. 大孔樹脂純化番石榴多酚的工藝優化[J]. 食品工業科技， 2013， 34（7）： 215-218.

[9] 鄺高波， 黃 和. 番石榴多酚體外抗氧化活性的研究[J]. 食品工業科技， 2014， 35（2）： 111-115.

[10] 王 杰. 苦瓜的抑菌作用及其活性物質的提取分離研究[D]. 楊陵： 西北農林科技大學， 2004.

[11] 嚴守雷， 王清章， 彭光華， 等. 蓮藕多酚對微生物抑制作用的研究[J]. 食品研究與開發， 2006， 27（2）： 148-151.

責任編輯：葉慶亮