PRSV CP—VPg嵌合型ihpRNA干擾載體轉化番木瓜的抗性分析

王樹昌

摘 要 利用pCAMBIA3300載體為背景，構建PRSV CP-VPg嵌合型植物表達干擾載體pCambia-hpRNA-CV，通過花粉管通道法將PRSV CP-VPg嵌合型植物表達載體遺傳轉化番木瓜，并將獲得的轉化番木瓜種子依次進行除草劑（PPT）篩選、PCR檢測。結果表明：獲得轉基因番木瓜植株5株，且RT-PCR實驗證明了目標片段在轉基因株系中得到表達。采用人工摩擦接種法對轉基因番木瓜株系進行攻毒實驗，結果顯示轉基因番木瓜植株對PRSV病毒表現出抗病特性，說明hpRNA-CV成功的干擾了病毒基因的復制。該研究結果為番木瓜抗PRSV育種提供了一種有效的研究手段。

關鍵詞 番木瓜；嵌合型ihpRNA；花粉管通道法轉化；PRSV

中圖分類號 Q949.759.6 文獻標識碼 A

Abstract A plant expression vector containing the chimeric hairpin RNA designed to target two sequences from the CP gene and the VPg gene of PRSV was transferred into papaya plants through pollen-tube pathway， which was constructing base on the pCAMBIA3300 vector. A total of 5 positive transgenic papaya plants were obtained after PPT-resistant selection and PCR analysis. RT-PCR experiments proved that the target segment expressed in the transgenic plants. The result of PRSV challenge-inoculation confirmed the 5 positive transgenic papaya plants didn't displayed symptoms and showed different degrees of resistance to PRSV. Its shown that hpRNA-CV vector interferes the replication of the virus gene successfully. The research provides an effective method for PRSV resistance-breeding of papaya.

Key words Papaya；IhpRNA；Pollen-tube pathway；PRSV

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.011

番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是熱帶、亞熱帶地區的毀滅性嚴重的病害，一直威脅著番木瓜種植業和加工產業的發展。目前，常規育種方法還難以防控PRSV。隨著基因工程抗病分子育種的發展，國內外研究人員先后將PRSV外殼蛋白、復制酶等基因導入番木瓜獲得了不同的抗PRSV的轉基因株系[1-2]，但研究結果發現由于各地區PRSV病毒株存在差異，導致一個地區的轉基因植物在另一個地區種植表現出的抗病能力減弱，甚至抗性喪失。因此，培育出穩定、高抗、譜抗且安全性好的新品種對發展中國番木瓜產業具有重要意義。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。外殼蛋白（Coat Protein， CP）基因介導的病毒抗性是研究最早的，也是目前應用最多的抗病毒基因工程，主要的研究集中在體外構建重組CP基因表達框，然后轉化植物，繼而使植物獲得對該病毒的抗性[3]。VPg是PRSV一種約25 ku的多功能蛋白，參與病毒侵染過程中的幾個階段，包括病毒RNA的復制、病毒細胞間和長距離運輸[4-9]，在病毒侵染過程中具有重要作用。在多種病毒侵染植物的過程中發現，蛋白質合成起始其重要作用的真核翻譯起始因子eIF4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E）[10]與病毒基因組連接蛋白（Viral genome-linked protein， VPg）的相互作用是病毒侵染植物的必須條件[4，9，11]。在前期的研究工作中，為了獲得高抗、譜抗的轉基因抗PRSV番木瓜，構建了靶向PRSV基因上2個部位CP和VPg的嵌合型ihpRNA結構[12]，本研究將通過花粉管通道法將該嵌合基因的iphRNA植物表達載體遺傳轉化番木瓜，獲得了對PRSV具有明顯的抗病特性的轉基因植株，為培育具有中國自主知識產權、高抗譜抗環斑病毒番木瓜新品系提供了基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取種植于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所試驗基地的番木瓜品種“穗中紅”作為轉化受體材料。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株、植物表達載體pCAMBIA3300均由本實驗室保存。

1.1.3 酶與試劑 各種限制性內切酶購自Ferments公司，PCR Mix購自TaKaRa公司，質粒、DNA和RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA植物表達載體的構建與鑒定 利用重疊PCR技術，基于PRSV海南分離株CP基因和VPg基因保守序列，設計引物，擴增具有嵌合CP基因和VPg基因的嵌合型ihpRNA結構[12]。然后利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切位點，將嵌合型ihpRNA結構插入pCAMBIA3300植物表達載體（圖1），命名為pCambia-hpRNA-CV。采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶對構建的pCambia-hpRNA-CV進行雙酶切鑒定。

1.2.2 質粒大量提取和純化 按照QIAGEN質粒大量提取試劑盒方法進行提取，獲得的質粒DNA溶于ddH2O中，終濃度為1 μg/μL，A260/A280比值為1.8左右，于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 花粉管通道法遺傳轉化番木瓜 選取數朵未開苞的兩性花（作為轉化用的花粉源）置于冰上，在待轉化株（雌株）上選定30朵左右未開苞的花（剪去同一花柄上其余花朵），小心逐一剝開花瓣，用微量移液器在雌花花蕾柱頭中央點入3～4 μL重組質粒溶液（1 μg/μL），立刻取預置于冰上的供體兩性花3～4枚雄蕊于柱頭上，合上花瓣，完成人工授粉后套上牛皮管袋隔離保濕，掛上標簽（注明導入質粒名稱、導入日期及操作時間）；（同時用ddH2O為對照，也按上述要求作同步平行操作）。第7天去除牛皮管袋，清除枯萎花苞及其標簽，并登記正常生長的子房數。為保障轉基因操作番木瓜果實生長所需營養的供給，剔除植株頂端其他未進行轉化操作的花及果實。待果實發育成熟，統計轉化果實發育座果率。將果實沿中央線縱切開，取出種子，去除假種皮后稍作晾干，播種沙床上育苗。

1.2.4 利用除草劑PPT對轉化番木瓜種苗進行初篩 待轉化番木瓜種苗第一片真葉伸展開時，利用120 mg/L PPT（1 L溶液中加入20 μL表面活性劑）涂抹幼苗葉片表面及生長點，隔天再涂抹1次。一周后觀察葉片反應，剔除葉片變枯黃的株系。

1.2.5 PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen DNA提取試劑盒提取轉基因番木瓜抗PPT種苗DNA，利用基因片段兩側引物P1/P2（P1：5′- TTGGTGACGTGCGAAATAGA-3′；P2：5′-TCCAG

ACATATCTGGCTGTATTTTTTTAAT-3′）。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后72 ℃延伸6 min。PCR產物利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 RT-PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen RNA試劑盒小量提取其RNA，-80 ℃保存備用。采用Tiangen公司KR106-2試劑盒進行反轉錄，以引物P1/P2進行PCR擴增反應。PCR反應程序為：98 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.2.7 PRSV接種攻毒試驗 使用本實驗室分離保存的PRSV-HN株系，通過人工摩擦接種的手段侵染番木瓜植株。選擇長勢相似的番木瓜植株，用清水將葉片沖洗干凈，并保持液面干燥。用0.1 mol/L PBS緩沖液（pH7.0）制備PRSV-HN病毒液。取保存PRSV-HN菌株的葉片用PBS液體比例為1 ∶ 10（W ∶ V），研磨成汁，低速離心后，取上清液做為毒源，冰上放置待用。病毒液中加入適量滅菌好的石英砂，混勻；用帶乳膠手套的手指蘸取病毒液，沿同一方向輕輕摩擦轉ihpRNA番木瓜葉片背面，直至可見少量輕微擦痕。以轉pCambia3300的轉基因番木瓜為陰性對照。接種5 min后，用無菌水沖洗葉片上多余的病毒液和石英砂；40 d內以每周為時間間隔，觀察病害發生情況并統計數據。

2 結果與分析

2.1 pCambia-hpRNA-CV植物表達載體的鑒定

將獲得的具有pCambia-hpRNA-CV的轉化菌落，擴大培養后提取其質粒。由圖2可知，工程載體質粒經PCR擴增后獲得了預期大小的目標條帶；利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切結果顯示得到了目標條帶，初步鑒定轉化菌落是正確的；將此單菌落送往測序，測序得到的核苷酸序列與目標序列一致。因此，表明目標片段已插入載體中，工程載體構建成功。

2.2 轉化番木瓜抗PPT種苗的篩選

為得到合適的用于篩選轉化番木瓜苗的PPT濃度，將不同濃度PPT溶液涂抹于野生型番木瓜種苗的第一片展開的真葉，3 d后即可觀察葉片出現不同程度的萎蔫。由圖3可知，對照組新葉生長良好，PPT在30～60 mg/L濃度時，處理真葉出現黑斑，葉片萎蔫，但仍有綠色；而PPT濃度達到120 mg/L時，新長成的真葉即可全部萎蔫，效果最佳。一周后，對照組葉片生長旺盛，處理組葉片死亡，沒有新葉發出。因此，選擇120 mg/L PPT溶液作為篩選濃度。

將篩選獲得的最佳濃度的PPT溶液涂抹于轉化種苗第一片展開的真葉上，一周后去除葉子變枯的植株，統計獲得的番木瓜抗性苗。由表1可知，獲得番木瓜轉化抗性苗41株，轉化植株篩選效率為17.6% 。

2.3 轉化ihpRNA番木瓜種苗PCR鑒定

將抗生素篩選為陽性的41株番木瓜幼苗移栽入溫室，作為檢測對象，以提取的葉片基因組DNA為模板，以插入片段兩側引物進行PCR擴增，同時以載體質粒作為陽性對照模板，以轉化有背景載體pCambia3300的轉基因植株作為負對照（沒有目標條帶的出現），進行PCR擴增檢測，將獲得目標大小片段的轉化番木瓜植株作為陽性株系（圖4），本實驗最終獲得pCambia-hpRNA-CV轉基因苗5株。

2.4 轉化ihpRNA番木瓜種苗RT-PCR驗證

提取PCR鑒定為陽性的5株番木瓜植株葉片RNA，經反轉錄后，進行RT-PCR檢測。結果顯示：篩選獲得的轉基因植株均表現為陽性，目標片段在轉基因植株內獲得穩定表達，目標片段成功轉入番木瓜內（圖5）。轉基因植株在形態、生長發育狀態等方面與非轉基因植株無明顯差異。

2.5 轉基因植株抗病性分析

通過分子檢測鑒定為陽性轉基因株系生長至約50 cm高時，接種PRSV病毒，3周后發現，對照組（轉pCambia3300株系，見圖6-A）番木瓜植株頂部葉片出現明顯的番木瓜環斑病癥狀，葉片由剛開始出現水漬斑點，逐漸葉片開始卷曲，新生葉片也出現卷曲，呈發病狀態；ihpRNA載體的植株發病時間晚于對照組（圖6-C、D），且發病癥狀明顯減輕，有的株系新生葉逐漸回復正常。

3 討論與結論

運用RNAi干擾技術進行植物抗病毒工程，通常都是針對目標基因單一位點的RNAi干擾載體的構建，但病毒基因組小，變異周期相對較短，因此采用針對單一位點的干擾不能滿足實踐需要。本研究采用的嵌合型ihpRNA載體具有可同時靶向多個基因或一個基因的多個部位的優點，這就可能增強轉基因植株對目標基因的干擾效率；另一方面，即使生物體發育過程中基因發生位點突變，嵌合型ihpRNA結構仍然能夠對其進行有效的干擾。

針對抗PRSV病毒的育種工作已有多年，基本都是圍繞CP基因和PRSV復制酶基因展開的，主要的研究集中在體外構建重組CP基因表達框，然后轉化植物，繼而獲得對該病毒的抗性[12]。國內外很多學者針對番木瓜PRSV病毒展開了研究，也取得了一定的成果。夏威夷大學的科學家們[13]將溫和突變體PRSV-CP基因導入番木瓜，成功獲得抗PRSV的轉基因植株，在2 a內無癥狀，但其抗性水平較低。張帆等[14]針對PRSV-CP基因設計dsRNA介導的轉化番木瓜植株，結果表現為抗PRSV。雖然這些轉基因番木瓜能夠抗PRSV病毒，但其抗性范圍窄，而且PRSV株系存在顯著區域差異。針對番木瓜轉基因育種中的這些問題，本研究針對PRSV海南分離株，采用融合基因（CP基因和Vpg基因）構建ihpRNA載體，進而轉化番木瓜，以期獲得廣譜的抗病性番木瓜；通過本實驗結果顯示：轉基因植株具有明顯的抗病活性，但其抗病活性能持續多久，后代是否會產生衰減現象，有待于進一步研究。

對于番木瓜的遺傳轉化來說，由于其再生體系尚不完善，轉化率低，利用愈傷組織農桿菌及基因槍轉化率低，很難獲得轉基因植株。這些條件的限制使得農桿菌、基因槍法轉化體系在番木瓜育種中很難得到推廣；另一方面，番木瓜是兩性株、花型大、種子豐富（每個果實少則數十顆，多則數百顆種子，能夠保證獲得足夠的轉化種子）、收獲周期短等性狀特征，使得利用花粉管通道法進行番木瓜遺傳轉化成為較好的遺傳轉化方法。此外，子房滴注法操作簡單，不需要昂貴的儀器設備，易于被育種工作者所掌握，便于此項技術的大面積推廣應用。

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