霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表達分析

林榕燕 賴鐘雄

摘 要 獲得甲羥戊酸生物合成途徑中的關鍵酶基因——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的信息是確定該基因與倍半萜類石斛堿含量相關性的重要基礎工作。本研究采用RT-PCR結合RACE技術，以霍山石斛原球莖為材料，克隆得到霍山石斛HMGR基因的全長cDNA序列，其在GenBank中的登錄號為KF011508。HMGR基因全長2 240 bp，包含144 bp的5′-UTR，407 bp的3′-UTR（含poly A），開放閱讀框為1 689 bp，共編碼562個氨基酸。生物信息學分析表明：該蛋白可能是定位于細胞質的一種疏水性不穩定蛋白，無信號肽，不含卷曲螺旋結構，具有14個功能位點、27個磷酸化位點，其二級結構由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成。系統進化樹分析表明，該基因與黃姜HMGR基因親緣關系最近，聚為同一類，主要負責催化萜類化合物生物合成途徑中的輔酶A和甲羥戊酸的生成。qPCR結果顯示：霍山石斛HMGR基因在莖中的表達量最高，而根中的表達量最低。

關鍵詞 霍山石斛（Dendrobium huoshanense）；HMGR基因；克??；生物信息學分析

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract Obtaining the information of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase（HMGR）gene， a key enzyme gene of the mevalonate biosynthetic pathway， is the basis in studying the relationship between this gene and sesquiterpenoids alkaloids. In this experiment， the full-length cDNA of the HMGR gene was successfully cloned from the protocorm of Dendrobium huoshanense by RT-PCR combined RACE.The accession number（KF011508）of this gene has been registered in GenBank. The full-length of HMGR gene is 2 240 bp， containing 144 bp 5′-UTR， 407 bp 3′-UTR（including poly A）and a 1 689 bp open reading frame， which encoding 562 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein is likely a kind of hydrophobicity and unstable protein located in the cytoplasm. This protein has 14 functional sites and 27 phosphorylation sites， but has no signal peptide and coil helix structures. The secondary structure was constituted by α- helix， β- folding and random coil. The phylogenetic tree analysis showed that this gene has the closest relationship with HMGR of Dioscorea zingiberensis，which is mainly catalytic the produce of coenzyme A and mevalonate in the terpenoid biosynthetic pathway. qPCR results showed that the expression level of HMGR gene from Dendrobium huoshanense was highest in stem while lowest in root.

Key words Dendrobium huoshanense； HMGR genes； Cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.016

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）屬蘭科石斛屬多年生草本植物，產于安徽省霍山縣，是國家重點保護的傳統名貴藥用植物[1]，也是歷代本草中記述最多、最為詳盡的一種石斛?；羯绞幱脙r值極高，功效奇特，資源稀少，價格昂貴，素有“中華仙草之最”的美稱[2]，其應用范圍正迅速擴大，需求量不斷增加，是眾多保健藥品和保健食品的主要原料之一[3-5]。但是霍山石斛對生長條件要求十分苛刻，加上人工過度采挖，其野生資源已瀕臨滅絕[6]。石斛屬植物中的倍半萜類生物堿是其主要有效成分之一，但含量一般較低[7]，因此通過基因工程手段提高倍半萜類生物堿的含量具有重大意義。

植物萜類化合物合成主要通過甲羥戊酸（MVA）途徑和脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途徑，在這2種途徑中，異戊二烯焦磷酸（IPP）是主要中間產物，由其生成單萜、倍半萜、二萜、三萜等化合物[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是甲羥戊酸（MVA）途徑中的限速酶[9]，能夠在甲羥戊酸途徑中催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸。目前，HMGR已經從馬鈴薯、紅豆杉、橡膠樹等多種植物中克隆出來[10-13]。大量研究表明，HMGR也是甲羥戊酸途徑中的一個關鍵調控位點，在植物萜類的生物合成方面具有重要的調控作用。將長春花HMGR基因轉到青蒿中，可以使青蒿中的青蒿素含量顯著提高[14]。在煙草中超表達陽春砂的HMGR基因，結果發現單萜、倍半萜、二萜、甾醇及植醇的總含量都提高了[15]。但目前還未有HMGR基因從霍山石斛中克隆得到的相關報道。

本研究從倍半萜類生物堿生物合成途徑出發，采用RT-PCR結合RACE技術克隆得到霍山石斛倍半萜類生物堿生物合成途徑中的關鍵酶基因（HMGR）的全長cDNA，并進行生物信息學和定量表達分析，希望為后續霍山石斛HMGR基因的功能驗證以及倍半萜類生物堿合成代謝工程改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為霍山石斛原球莖，由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。將試驗材料放于繼代培養基中培養50 d后，取生長旺盛的原球莖為材料進行試驗。繼代培養基的配方為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA，其中蔗糖20.0 g/L，瓊脂粉6.0 g/L，pH值5.7，溫度（25±2）℃，光照時間12 h/d，光照強度1 200～2 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 霍山石斛原球莖RNA的提取及cDNA的合成

采用Tripure法[16]進行霍山石斛原球莖總RNA的提取，提取得到的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經分光光度計檢測其純度。而后直接用于cDNA第一鏈的合成或置于-80 ℃條件下保存備用。保守區擴增、3′RACE以及開放閱讀框（ORF）驗證過程中所用的cDNA的合成都是采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒，5′RACE 所需cDNA的合成采用System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的試劑盒進行，產物均置于-20 ℃保存。

1.2.2 霍山石斛HMGR基因的引物設計及PCR擴增 從NCBI上下載與霍山石斛相關的HMGR基因序列，根據同源克隆的原則設計基因保守區的上下游引物。根據HMGR基因保守區的測序結果設計3′RACE的2條正向特異引物以及5′RACE的2條反向特異引物。將獲得的目的基因的5′RACE序列、ORF驗證序列及3′RACE序列采用DNAMAN 軟件進行拼接，得到該基因的cDNA全長，并在ORF外或起始密碼子和終止密碼子處分別設計一對引物用于ORF的擴增。本研究所用的引物見表1。

以反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 45 s，退火45 s，72 ℃延伸1 min/kb；共35個循環；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保持1 h。各環節的退火溫度及延伸時間見表1。PCR擴增產物通過瓊脂糖（1%）電泳進行檢測。采用DNA快速純化回收試劑盒（Solarbio）回收目的片段，以pMD-18T（TaKaRa）連接載體，Escherichia coli（DH5α）感受態（TianGen）對回收片段進行連接、克隆和轉化。陽性克隆子送上海博尚生物公司測序完成。

1.2.3 生物信息學分析 利用在線ExPASy（http：//www.expasy.org/resources/）蛋白分析軟件ProtParam、ProtScale、COIL、SWISS-MODEL對蛋白進行理化性質分析和卷曲結構、三維結構預測；利用在線CBS Prediction Servers蛋白分析軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）中的SignalP、TMHMM、NetPhos對蛋白進行信號肽、跨膜結構預測和磷酸化位點分析；利用http：//psort.hgc.jp/form.html進行亞細胞定位；利用NCBI的Conserved Donain Search在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白保守結構域的預測；利用PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）對該蛋白的功能位點和二級結構進行預測；并利用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4 霍山石斛不同組織材料的HMGR基因定量表達分析 本研究以18S rRNA為內參基因，檢測目的基因HMGR在霍山石斛試管苗不同組織中的相對表達量。采用Takara SYBR ExScript試劑和羅氏LightCycler480儀器，以霍山石斛的老葉、幼葉、根和莖稀釋后的cDNA作為模板，HMGR-F和HMGR-R作為上下游引物進行qPCR擴增，具體操作流程參照吳高杰[16]的研究。反應結束后進行溶解曲線、擴增曲線等的分析，檢測引物的特異性。在樣品擴增反應前先以試驗中不同cDNA模板的混合樣不同稀釋倍數進行標準曲線的制作，以上每個反應包括3個重復。

2 結果與分析

2.1 霍山石斛原球莖總RNA的提取

提取得到的霍山石斛原球莖總RNA，其A260/A280值在2左右，A260/A230值大于2，質量較好，28 S rRNA和18 S rRNA條帶都較清晰，且28 S rRNA條帶亮度約為18 S rRNA 2倍。RNA在-80 ℃條件下保存備用。

2.2 霍山石斛原球莖HMGR基因cDNA全長序列的獲得

以反轉錄合成的保守區cDNA 第一鏈為模板，采用相應的引物擴增得到約544 bp 的特異性條帶，經NCBI數據庫比對，確定其為目的條帶。根據保守區序列設計引物，進行5′和3′擴增，經測序后分別得到1 048 bp和1 080 bp的目的條帶。將所獲得的HMGR基因的3′RACE、保守區序列和5′RACE序列進行拼接，而后根據拼接的全長序列設計相應的ORF驗證引物，擴增得到1 754 bp左右的特異性條帶，測序結果在GenBank數據庫中在線進行Blast，結果表明所得片段為霍山石斛HMGR基因序列。該cDNA全長2 240 bp，包含144 bp的5′UTR，一個完整的共1 689 bp的 ORF（145-1833），以及407 bp的3′UTR（含poly A）。該cDNA序列共編碼562個氨基酸，已登錄GenBank，登錄號為KF011508。

2.3 霍山石斛原球莖HMGR氨基酸序列比對

選取包括霍山石斛在內的7種植物的HMGR氨基酸序列，利用DNANAN軟件對其進行序列多重比對分析。用不同顏色深淺背景來表示其相似性的高低，顏色越深相似性越高，相似性最高的地方可能存在著重要功能結構域。分析結果表明，不同植物的HMGR之間具有較高的相似性，其相似性達到75.67%（圖1）。并且，在所選擇的7種植物中，霍山石斛與同屬于蘭科的鐵皮石斛和萬代蘭的相似性較其它植物高。同時發現，霍山石斛HMGR的功能域氨基酸組成與其它植物幾乎一致，即兩個HMG-CoA結合基序-EMPVGYV/IQL/IP和TTEGCLVA（圖中用方框表示），兩個NADPH結合基序-DAMGMNM和GTVGGGT（圖中用下劃線表示）。

2.4 霍山石斛原球莖HMGR基因生物信息學分析

2.4.1 蛋白質基本理化性質分析 利用ProtParam對霍山石斛HMGR蛋白質進行理化性質分析，發現該蛋白由562個氨基酸組成，分子量為60.0 ku，理論等電點為8.41，由20種氨基酸組成，其中Ala、Leu和Ser所占比重較大，比例分別達到10.5%、10.3%和9.4%，Trp含量最低。負電荷氨基酸殘基總數為（Asp+Glu）為51，正電荷的總數（Arg+Lys）為56，分子式：C2 651H4 269N727O792S33，原子總數：8 472。預測結果還顯示該蛋白不穩定系數為40.42，高于域值40，是一個不穩定蛋白；脂肪系數為93.58；總平均疏水指數（GRAVY）為0.125，表明它是一個疏水蛋白。

利用ProtScale對蛋白的親水性和疏水性進行預測，結果表明：在第88個氨基酸表現為疏水性最強，為2.733；在第549個氨基酸表現為親水性最強，為-2.256，并且疏水氨基酸的數量大于親水氨基酸的數量，所以推斷HMGR蛋白為疏水性蛋白，其結果與ProtParam軟件中預測的相似。

2.4.2 跨膜結構預測分析 利用TMHMM工具對霍山石斛HMGR蛋白的跨膜結構進行預測（圖2），結果表明：HMGR可能會在81～103位氨基酸處形成一個跨膜螺旋，HMGR蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為41.387 87遠大于18，因此該蛋白很可能是一個跨膜蛋白。從N末端開始的前60個氨基酸期望值（Exp number，first 60 Aas）為9.425 54，小于10，因此可以預測霍山石斛HMGR蛋白不具有信號肽的序列，其中81～103處的跨膜螺旋可形成N末端在膜內的跨膜螺旋的概率達到了0.570 38，由此也可以推斷霍山石斛HMGR蛋白可能是一個跨膜蛋白。

2.4.3 信號肽預測分析 運用SignalP 4.1 Server對霍山石斛HMGR蛋白的信號肽進行預測。結果如下：霍山石斛HMGR剪切位點值（C值）最大為0.114，Y值（綜合考慮S值和C值的一個參數）最大為0.120，從N端氨基酸開始到剪切位點（1～10位）各氨基酸的平均值（Smean）為0.132，此段的D值（S平均值和Y最大值的加權平均值）達到了0.125，小于0.5。由此看出，霍山石斛HMGR蛋白不含有信號肽，推斷其不是分泌蛋白，該蛋白可能是在細胞質中合成后保留在細胞質基質中，而不參與細胞內的運輸作用。對其它植物的HMGR氨基酸序列的信號肽進行分析也得到了一樣的結果，即HMGR不具有信號肽。

2.4.4 亞細胞定位預測分析 蛋白質只有處于特定的亞細胞位置才能發揮其功能，故亞細胞定位對蛋白質的功能研究存在著十分重要的意義[17]。運用PSORT軟件對霍山石斛HMGR蛋白的亞細胞定位進行預測，結果表明：霍山石斛HMGR定位于線粒體內膜的可能性最大，為68.8%。其次是細胞膜，可能性為60.0%。定位于高爾基體和葉綠體類囊體膜的可能性較低，分別為40.0%和30.9%。由此可以推測該蛋白主要在細胞質中參與代謝活動。

2.4.5 磷酸化位點和功能位點的預測分析 蛋白質磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的重要內容之一，其對蛋白質活力和功能有著重要的調節和控制作用[18]。利用NetPhos 2.0 Server預測霍山石斛HMGR蛋白的磷酸化位點，結果表明在多肽鏈中可能發生磷酸化的有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），其中以絲氨酸磷酸化位點最多，有18個，預測的最高分達到0.995，在第109位氨基酸處；其次是蘇氨酸，達到7個磷酸化位點，分別為第16、44、184、237、277、395、412位氨基酸處；酪氨酸的磷酸化位點只有2個，分別在第198和212位氨基酸處。

通過PredictProtein在線軟件對霍山石斛HMGR蛋白功能位點進行預測與分析。結果表明，該蛋白含2個N-糖基化位點（ASN_Glycosylation）、11個蛋白激酶C 磷酸化位點（PKC_Phospho_site）、5個蛋白激酶II 磷酸化位點（CK2_ Phospho_site）、10 個N-酰基化位點（Myristyl）、1個羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號1位點、1個羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號2位點和1個羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號3位點。

2.4.6 保守結構域的預測分析 蛋白結構與其發揮的功能密切相關，結構的保守性與功能的保守性呈正相關。通過NCBI-CDS在線軟件分析霍山石斛HMGR蛋白的保守結構域，結果發現該蛋白含有典型的HMG-CoA_reductase_class1保守結構域（第146～549位），該基因序列主要負責催化萜類化合物生物合成途徑中的輔酶A和甲羥戊酸的生成。這些結果進一步說明了本實驗克隆所得的霍山石斛HMGR基因屬于HMGR基因家族（圖3）。

2.4.7 卷曲螺旋的預測分析 利用COILS對霍山石斛HMGR蛋白進行蛋白卷曲螺旋預測，結果顯示：霍山石斛HMGR蛋白在window=14、21和28時，形成卷曲螺旋的預測概率都較低，均遠低于0.5，說明霍山石斛HMGR蛋白不能形成卷曲螺旋結構。

2.4.8 二級結構和三級結構的預測分析 蛋白質二級結構對于深入研究蛋白質的生物活性具有重要作用。利用PredictProtein對霍山石斛HMGR蛋白的二級結構分析的結果為：HMGR的結構由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成。在整個蛋白中，α螺旋和無規則卷曲所占比例較大，分別為45.91%和41.64%，而β折疊只占12.46%。

以人類（Homo sapiens）的HMGR（2q6bA）作為模型，利用SWISSMODEL對霍山石斛HMGR蛋白進行同源建模，得到其三維結構如圖4所示?？梢钥闯鲈摰鞍椎闹饕Y構元件是α螺旋、β折疊和無規則卷曲。

2.4.9 系統進化樹的構建 將從NCBI數據庫中下載具有代表性的物種的HMGR蛋白與霍山石斛HMGR的編碼蛋白，采用MEGA5.0軟件分析構建HMGR的系統進化樹（圖5）。從進化樹結果可以看出，HMGR根據種屬關系被準確的分為植物、動物和真菌3大類，霍山石斛HMGR與黃姜HMGR的親緣關系比較近，聚為同一類，因此可以推測霍山石斛HMGR與黃姜HMGR的功能間具有一定的相似性，在甲羥戊酸途徑中起到調控作用。

2.4.10 霍山石斛試管苗不同組織中HMGR基因定量表達分析 在溶解曲線、擴增曲線及標準曲線滿足試驗要求的前提下，以18 S rRNA為內參基因，檢測霍山石斛試管苗不同組織中HMGR基因的表達水平，其相對表達量見圖6。HMGR基因在莖中的相對表達量最高，葉次之，且幼葉要高于老葉，根中最少。

3 討論與結論

3.1 霍山石斛HMGR蛋白的結構功能預測

HMGR基因作為萜類生物合成途徑中的關鍵酶基因而倍受關注，目前已從巴西橡膠樹、馬鈴薯、紅豆杉等植物中分離克隆。將獲得的霍山石斛HMGR基因ORF推導的氨基酸序列登錄到NCBI網站，用BLAST進行蛋白質相似性檢索，發現該序列與金釵石斛（AFD23288.1）的相似性最高達到了97%，與其他植物比較也具有較高的相似性，基本都到達70%。序列和結構較高的相似性說明HMGR基因在植物中具有很高的保守性，說明本次克隆得到的HMGR基因序列準確可靠，屬于HMGR基因家族的一員。

從生物信息學的角度對核酸和氨基酸序列進行分析，并對其結構和功能進行預測，可為生命現象的本質提供一定的理論參考依據[19]。對霍山石斛HMGR蛋白進行生物信息學分析，發現該蛋白屬于疏水性的跨膜蛋白，不含信號肽結構，推斷其是一種在細胞質中直接行使其作用的蛋白。對其它植物HMGR的生物信息學進行分析得到一樣的結論。在重要功能域方面，霍山石斛HMGR擁有與其他植物幾乎相似的氨基酸組成，即2個HMG-CoA結合基序（EMPVGYVQLP和TTEGCLVA）和2個NADPH結合基序（DAMGMNM和GTVGGGT）。有研究表明，TTEGCLVA中的谷氨酸Glu在HMGR起催化作用過程中占據重要位置[20]。本研究獲得的霍山石斛HMGR基因的序列信息以及結構分析，可為后期通過分子生物學手段調節HMGR的基因表達，進而研究HMGR基因的表達水平與倍半萜類石斛堿含量的相關性，從而提高倍半萜類石斛堿的含量奠定基礎。

3.2 HMGR基因與霍山石斛倍半萜類生物堿合成的相關性

MVA途徑長期以來被認為是萜類化合物合成的重要途徑，而HMGR基因則被認為是該途徑中的一個重要調控點，其表達水平與許多萜類化合物生物合成密切相關。在研究青蒿素生物合成代謝中發現，HMGR作為該途徑的限速酶，其酶活性的調節影響細胞中甲羥戊酸的儲蓄和青蒿素的積累[21-23]。在丹參的毛狀根中超表達HMGR基因，發現不僅植物酶活性提高，丹參酮和角鯊烯的產量也有所增加[24]。杜娟[25]在對蹄葉橐吳萜類化合物-紫菀酮的研究中發現相比于野生型對照植物，超表達HMGR基因的轉基因植株中紫菀酮的含量較多。將N端缺失的HMGR基因在轉基因薰衣草中過表達，結果促進了薰衣草精油及植物甾醇的產生[26]。

為了解HMGR基因與霍山石斛倍半萜類生物堿合成的相關性，本研究對霍山石斛不同組織中HMGR基因進行了定量表達分析，結合丁亞平[27]等對霍山石斛不同組織中生物堿含量的研究發現，HMGR基因在葉和莖中的表達水平要明顯高于根中，而生物堿含量為葉>莖≈根。導致該現象的可能原因有：霍山石斛生物堿的生物合成是經過多步生化反應后才完成的，HMGR的催化作用處于較上游，其后還有多種酶的相互協同作用影響著生物堿的合成；霍山石斛生物堿的合成除了通過MVA途徑外，還可能通過MEP途徑和莽草酸途徑。

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