全基因組擴增應用于胚胎植入前遺傳學診斷

摘要：植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是指借助顯微操作技術對具有高遺傳病風險夫婦，從其體外受精培養得到的胚胎中取出個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養層細胞進行遺傳學檢查，通過分析選擇正常的胚胎移植，可以防止遺傳學異常妊娠的發生，將產前診斷提前到胚胎植入子宮內膜之前。避免了反復流產、引產對孕婦及其家庭造成的傷害。但由于可用于PGD分析的材料為胚胎中取出的個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養層細胞，這些材料十分有限，所以在進行PGD之前，需對單細胞進行全基因組擴增（whole genome ampliflication，WGA），全基因組擴增一組在基因組DNA數量極有限情況下對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量，對進行疾病診斷的組織或單個細胞的基因組進行大量擴增，使得后續分析的模板量增加，從而完成多位點、多基因的檢測研究。該技術能很好的解決PGD的標本少和準確性要求高等要求。本文介紹了WGA方法中PEP、DOP-PCR、MDA應用于PGD的情況，分析了MDA方法的優勢與不足。

關鍵詞：植入前遺傳學診斷；全基因組擴增；多重置換擴增

【中圖分類號】R596.3 【文獻標識碼】A【文章編號】1002-3763（2014）02-0001-02

作者簡介：楊超（1988-），男，碩士研究生，研究方向：胚胎植入前遺傳學診斷

1 引言

伴隨著人類輔助生殖技術的發展，特別是體外受精-胚胎移植（IVF-ET）及單精子胞漿內顯微注射（ICSI）的廣泛應用，使得越來越多的不育患者實現了生育下一代的愿望，但隨之而來的遺傳病的患病風險也明顯增加[1]，而胚胎植入前遺傳學診斷卻能有效地降低后代患遺傳病的風險，故胚胎植入前遺傳學診斷將成為臨床檢驗的重要手段。

胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）是指借助顯微操作技術對具有高遺傳病風險夫婦，從其體外受精培養得到的胚胎中取出個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養層細胞進行遺傳學檢查，通過分析選擇正常的胚胎移植，可以防止遺傳學異常妊娠的發生，將產前診斷提前到胚胎植入子宮內膜之前。該技術包括體外受精胚胎移植（in vitro fertilizatio-and embryo transfer， IVF-ET）的臨床手段，聚合酶鏈式反應（PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybrid dization， FISH）等檢測技術。

全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）是一組在基因組DNA數量極有限情況下對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量，對進行疾病診斷的組織或單個細胞的基因組進行大量擴增，使得后續分析的模板量增加，從而完成多位點、多基因的檢測研究。該技術現已應用于法醫學、疾病基因研究、產前診斷等領域。近年在胚胎植入前遺傳學診斷中的應用也受到關注[2]。

2 全基因組擴增（WGA）的方法

聚合酶鏈反應（PCR）技術的產生和發展極大得推進了微量DNA樣本的分析，但由于許多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或幾次PCR反應。為了能從極少量細胞中最大限度的獲取信息，需要用全基因組擴增技術（WGA）將原始DNA序列放大。

WGA技術如今已經發展形成以PCR為基礎的PEP和DOP-PCR技術和不以PCR為基礎使用隨機引物恒溫擴增的多重置換擴增技術（multiple displacement amplification，MDA）。

2.1 PEP和DOP-PCR技術

引物延伸預擴增（Primer extension preamplification，PEP）用到的是PCR技術、Taq酶和由15個堿基的隨機寡聚核苷酸組合出415種不同序列的引物，其變性后在37℃條件下低溫退火，然后緩慢升至55℃延伸，隨機擴增基因組DNA，擴增產物覆蓋接近基因組96%區域，同時放大1000倍[3]，PEP后續采用巢式PCR或以其終產物為模板，使用特異的引物序列進行擴增，從而到達檢測的目的。普通PEP的總反應時間需經歷14h，其較長時間的反應周期阻礙了其在臨床PGD檢測中的應用。在改善普通PEP的反應體系以及熱循環條件后，其反應時間縮短至5.5h[4]，雖然反應時間縮短，但改良后的PEP仍然保持著原有擴增效率，甚至提高了擴增的特異性，其命名為改良的引物延伸反應預擴增（improve-PEP，I-PEP）。2003年Jiao等[5]應用PEP結合巢式PCR技術及反向點雜交技術（RDB）的方案，對β-地中海貧血攜帶者行PGD，成功出生了健康的小孩。然而，普通PEP擴增產物的長度達不到1500bp，較低的擴增率、產生片段的過短成為PEP技術在PGD中廣泛應用的最主要障礙。

另一種WGA方法是簡并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR），其操作相對PEP更簡單，采用部分簡并寡核苷酸引物，這些引物會結合于整個基因組序列，在低退火溫度運行幾個循環擴增，讓引物充分與基因組DNA結合，隨后提高退火溫度進行更特異的擴增。DOP-PCR能將DNA模板能從開始時的15pg增至400ng，且能按比例均勻擴增整個基因組DNA[6] 。但和PEP一樣，DOP-PCR只能擴增出相對較短的產物，2002年Kittle等[7]將其改良，其使用核酸外切酶矯正DNA聚合酶的活性，增加DOP-PCR退火和延伸的時間，其結果是擴增產物長度由原來0.5kb增至10kb，更好地覆蓋了微隨體區域和單拷貝序列。

2.2 多重置換擴增（MDA）技術

MDA技術是目前最受關注的WGA技術，不同于以PCR為基礎的PEP和DOP-PCR技術存在擴增產物過短、偏性擴增明顯等缺點，該技術是不需以PCR為基礎的具有更高擴增效率、更廣覆蓋域及更高保真度的新的擴增技術。

MDA是一種基于鏈置換和環狀滾動擴增的全基因組擴增技術。該技術利用一種φ29 DNA聚合酶催化六聚體隨機引物對基因組進行擴增，其反應條件為在30℃下恒溫。擴增時，六聚體隨機引物在多個位點與模板DNA退火，在φ29 DNA聚合酶的作用下同時啟動復制。引物沿著模板鏈延長，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又作為新的模板完成一次擴增，經過長時間的循環，最終經過65℃滅活可獲得大量的DNA。該技術適用于各種樣本，低DNA含量的樣本，尤其是在臨床應用中常出現的單細胞取材，如單個淋巴細胞、單個精子、單個滋養層細胞或卵裂球等。也可直接從新鮮或干燥的全血、白膜層和培養的細胞等進行擴增，也可是石蠟包埋的樣品，但效果較差[8]。

在臨床應用中，MDA表現出高擴增效率和精確性，相較于以PCR基礎的WGA方法，MDA表現出顯著的優勢。2009年Ren等[9]通過MDA技術擴增單細胞基因組DNA完成兩家DMD臨床PGD實驗，每個家系均分析了一個DMD基因的突變位點和6個STR連鎖標記，最后各出生一個健康的女孩。2010年Eduardo等[10]用MDA技術結合PCR-連鎖分析完成了1家PKHD1家系的臨床PCR實驗，他們共分析了20個PKHD1基因及其側翼序列中的STR位點，最終出生了一個健康孩子。

2.2.1 MDA技術的優點

首先是其持續合成能力，MDA方法比以PCR為基礎的擴增方法擴增效率更高，可將微量模版擴大數千倍以上。φ29DNA聚合酶的合成力極強且持續時間長，產物片段平均長度可大于10kb。而在PCR反應中，反復的變性和退火約40個循環左右，DNA擴增即進入平臺期，MDA因為其反應全程恒溫，其酶活性能持續長達16小時，從而可產生足夠量的DNA來完成PGD及STR位點的檢測[11]。第二，MDA方法的脫扣率較以往PCR基礎的擴增方法進行WGA低。在微衛星基因座上滑脫是的WGA一個大問題，φ29DNA聚合酶從理論上講能減少微衛星在基因座上的滑脫率。第三，MDA方法的高保真性，φ29DNA聚合酶具有外切酶活性，可均勻擴增DNA而不出現擴增偏差，其錯配率僅為1：106 ～1：107，而TaqDNA酶的錯配率3：104[13]，相較之下φ29DNA聚合酶可保證擴增效果。第四，無論MDA擴增起始濃度差異多大，其終濃度穩定，基因組DNA經過30℃反應6～8h，擴增在達到高峰后維持于一個穩定水平使所有反應的DNA產量保持在20～30μg左右。

2.2.2 MDA技術的不足

MDA目前仍然存在一些不足，2005年Sun等[15]綜合比較了I-PEP、MDA方法的優缺點，結果提示MDA方法擴增效率大于I-PEP方法，但特異性較I-PEP差，片段大小差別大，在一些微衛星位點分型時，可能會發生脫扣。MDA反應靈敏度極高，起始模板量少故極易污染，若用單個細胞做PGD，污染問題將會更加突出。污染物與待檢測模板競爭擴增，經PCR放大后極大影響了診斷的準確性。

3 單細胞WGA擴增后續分析技術

3.1 單體型分析

胚胎植入前單體型分析（Preimplantation genetic haplotyping，PGH）是PGD中一個新的方法，是利用短串聯重復序列（STR）在DNA復制過程中會發生一個或幾個單位的重復或缺失的特點，在人群重復次數會出現特異且符合孟德爾遺傳定律的原理，進行家系分析確定攜帶突變的染色體的簡易診斷的手段，其最大的優勢是能發現任何單基因病甚至已確定的缺失。但是需要在進行PGH分析之前仔細研究至少有一個患者的家系中并找到一些能用于攜帶者的連鎖標記。2006年Renwick等[16]成功用MDA產物通過PGH方法應用于囊性纖維變性和DMD并使受孕。

現在，PGH應用了將熒光標記在PCR擴增引物上的熒光PCR，并通過熒光電泳進行單體型分析，大大縮短了PGH的時間，作為一種代替診斷的方法，PGH增加了PGD診斷的范圍和可用性。

3.2 SNP分型

單核苷酸多態（Single nucleotide polymorphism，SNPs）是占人類基因突變的很大比例并會增加人類患病風險的單核苷酸改變。但SNP關聯分析需要足量的基因組DNA，WGA使之成為可能。WGA之后的SNP分析不僅提供了一種可靠的評估DNA產品的方法，同時在探究染色體畸變實驗中也呈現出高精確性和可重復性，2009年ling等[17]通過MDA結合SNP分析的方案成功發現了產生了單體和三體的染色體數目畸變。WGA結合SNP方案尚處在發展的初級階段，以后的發展不可估量。

4 總結

PGD中可獲得的細胞數量、DNA都極其有限。進行PGD分析需要大量反映原始遺傳信息的DNA，WGA用于PGD基因分析令人鼓舞，其恰好解決了這種單細胞擴增的問題且臨床檢測技術使用正不斷發展。尤其是MDA技術打開了需要大量DNA的多重檢測之門，使后續各種DNA分析技術得以開展，現在也成最主要的WGA技術。WGA后續的操作如PGH、SNPs等將PGD適用的范圍擴大。盡管不同的WGA方法都有其優勢與不足，未來的發展將不斷改善，比如如何減少甚至避免小量標本的擴增假象、如何減少擴增中出現的偏向擴增和等位基因脫扣、如何避免污染等問題。WGA為PGD的效率、可操作性等方面帶來了光明前景，可以想象在不遠的將來WGA極有希望成為PGD重要而不可缺少的組成部分。

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