大環內酯類藥物愛樂新體外抑制歐洲型和北美型藍耳病毒的復制

摘 要：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種動脈炎病毒，主要感染肺泡巨噬細胞。在體外，這種病毒可以在篩選過的猴細胞系上生長，如MA104細胞。本試驗檢測了愛樂新、替米考星、泰樂菌素這3種大環內酯類抗生素在MA104細胞上抑制PRRSV的能力。結果顯示愛樂新有抗病毒效果，替米考星也有一定效果。泰樂菌素沒有抗病毒作用。PRRSV感染需要核內體有較低的pH值。研究證明，愛樂新可以提高核內體的pH值，這可能是愛樂新抑制PRRSV復制的一個重要機制，不過也可能涉及其他的因素。

關鍵詞：PRRSV；愛樂新；替米考星；泰樂菌素

豬繁殖與呼吸綜合征是對現代養豬生產具有重要經濟意義的疾病，僅美國每年就造成了數億美元的損失（Neumann等，2005）。該病的病原體為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），它是一種動脈炎病毒，主要在肺泡巨噬細胞內復制。該病可以感染各種年齡的豬只，但呼吸癥狀通常出現在青年豬。生殖癥狀見于后備母豬和經產母豬，表現為流產、木乃伊胎、不能正常發育的弱仔。易感的懷孕母豬在妊娠的最后3個月感染了PRRSV將特別容易導致這些生殖癥狀。PRRSV可以通過病毒感染的精液傳染母豬。

豬繁殖與呼吸綜合征于1987年在美國首次報導，不久歐洲也報導。血清學調查表明加拿大的豬只在20世紀70年代末感染此病（Rossow，1998）。在歐洲，Wensvoort等首次分離到PRRSV（1991），在北美洲由Collins等分離（1992）。有意思的是美國和歐洲的分離株具有不同的基因組和抗原性差異。當進行氨基酸比對時，2個毒株病毒表面的主要糖蛋白的差異達到40 %。所以將這種病毒分為1型（歐洲型）和2型（美洲型）。為何一個新的豬病毒在兩個大陸沿著不同的譜系進化？為何它們又幾乎在同一時間發病？這些都有待解決。Hanada等（2005）提出，這種病毒大概在上世紀80年代從其他物種傳染了豬，而且直到現在這種病毒還在通過改變其糖蛋白的跨膜區以適應豬細胞。有報道稱在檢測的所有RNA病毒中，PRRSV的進化速度最快。在其他動脈炎病毒中，鼠的乳酸脫氫酶增高癥病毒和PRRSV存在較近的親緣關系。

PRRSV高突變率的結果是該病毒的兩種類型存在巨大的基因和抗原性差異。Stadejek等（2002）報道了東歐1型PRRSV毒株和其他1型PRRSV之間的差異。根據早期的分離株研發的PRRSV疫苗初期證明很有效，但是野毒株的抗原變異降低了疫苗效果。活疫苗可以減少或甚至消除野毒株造成的病毒血癥，不過扁桃體仍會分泌PRRSV。滅活疫苗的效果似乎有限，即使抵抗同源毒株也效果欠佳（Zuckermann等，2007）。1型PRRSV疫苗不能預防2型毒株（van Woensel等，1998）。同時感染疫苗株和野毒株也是可能的。

一些研究表明，替米考星可能有抗PRRSV的抗病毒效果（Molitor等，2001；Benfield等，2002），但是只有當濃度達到400 mg/L時才有效果。愛樂新?產品含有大環內酯類抗生素泰萬菌素。以前發表的文獻（Stuart等，2007）證明泰萬菌素進入細胞和在胞內的蓄積比替米考星更快。泰樂菌素是另一種大環內酯類，它的胞內蓄積很差。本研究的目的是測試這3種大環內酯類抗生素在體外抗PRRSV的效果。

1 材料與方法

1.1 細胞系

MA104細胞由英國吉米·格雷博士贈送。細胞在添加10 %的胎牛血清，100 IU/mL青霉素（Invitrogen公司）和100 μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的格拉斯哥培養基中培養。

1.2 PRRS病毒株

歐洲型（1型）毒株，DV毒株（Porcilis PRRS，英特威公司）為市場上購買的疫苗株。將毒株在MA104細胞上擴繁培養。存貯培養的病毒滴度為108空斑形成單位（pfu）/mL。美洲型（2型）毒株，VR2332（Benfield等，1992），來自美國標準菌種庫（American Tissue Type Collection，ATCC）。35 ℃在MA104細胞上擴繁病毒（按照菌種庫的要求），存儲培養物的滴度為5×107 pfu/mL。

1.3 大環內酯抗生素

由伊科拜克動物保健品公司提供的愛樂新口服溶液。該產品含有抗生素泰萬菌素。替米考星預混劑Pulmotil（含有250 μg/mL的鹽酸替米考星）和Tylan（含有1 g/g泰樂菌素）均購自Elanco動物保健公司。

1.4 測定3種大環內酯類藥物的抗PRRSV效果

將105 MA104細胞接種在24孔板，于37 ℃培養過夜。將細胞用不同濃度的大環內酯類抗生素在37 ℃處理4 h。然后在含有大環內酯類抗生素的培養基中，以每個細胞10 pfu的感染復數將細胞感染1型和2型PRRS病毒。細胞在適合溫度下培養20 h，然后用4 %（體積比）的甲醛/磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS）固定。用間接免疫熒光測定感染情況。

1.5 免疫熒光

在室溫下用0.2 %（體積比）的Triton X-100/PBS處理細胞5 min以增加其滲透性。用單克隆抗體（由瓦格寧根大學的Michael Kroese博士惠贈）檢測1型病毒的核蛋白。用單克隆抗體2D6（美國VMRD公司）檢測2型病毒的核蛋白。抗體分別按1/10和1/500的比例稀釋在含有0.2 %胎牛血清的PBS中，室溫孵育30 min，PBS-NCS洗滌2次。二抗是羊抗鼠IgG，偶聯Alexa Fluor 488（Invitrogen公司），以1/1 000的比例稀釋到PBS-NCS中，室溫孵育30 min，PBS-NCS洗滌2次。用含有DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸鹽）的ProLong封固劑（Invitrogen公司）將蓋玻片放在載玻片上，然后用共聚焦顯微鏡觀察。所有的細胞用DAPI染色，PRRSV陽性細胞通過免疫熒光染色。

1.6 吖啶橙細胞染色

將105 MA104細胞接種于24孔板，于37 ℃培養過夜。將細胞用不同濃度的大環內酯類抗生素處理4 h，或不處理。加水配制成2 mM的吖啶橙儲備樣品（Invitrogen公司），加到組織培養基中，使終濃度為20 μM。將細胞在室溫下孵育1 min，PBS洗2次。利用ProLong封固劑，將蓋玻片移開并立刻放在載玻片上。用共聚焦顯微鏡觀察。細胞發出帶有吖啶橙的綠色熒光。在酸性的細胞區域（如次級內體和溶酶體）不見綠色熒光，而呈現紅色熒光。對20個細胞內的紅色熒光點進行計數，將其平均數量繪制成圖表。

2 結果

2.1 大環內酯類的抗病毒效果

圖1顯示的是愛樂新?和替米考星對1型PRRSV（歐洲型）感染的抑制效果。從圖中可以清楚的看到，用愛樂新?處理MA104細胞可以減少表達病毒抗原細胞的數量。每次處理后，表達PRRSV抗原的細胞數僅是總細胞數的一部分（見圖2a）。當愛樂新的濃度為0.1 μg/mL，1型PRRSV的復制降低了將近50 %。替米考星也有抗病毒作用，不過濃度為0.1 μg/mL沒有抑制效果，但是濃度為1 μg/mL時，PRRSV陽性細胞減少了約50 %。由于替米考星對細胞的毒性作用，沒有顯示濃度為10 μg/mL的結果。在本研究中，泰樂菌素沒有抗病毒作用，即使濃度達到100 μg/mL。

用愛樂新或替米考星在特定的濃度下處理MA104細胞4 h，然后在藥物一直存在的情況下，用1型PRRSV（DV株）感染細胞，感染復數為10。20 h后固定細胞，用間接免疫熒光檢測病毒感染的細胞，綠色熒光為病毒的核蛋白，紅色熒光為α-微管蛋白。

按前文的方法將MA104細胞用抗生素處理并進行病毒感染。20 h后固定細胞，用間接免疫熒光檢測病毒核蛋白，以此來檢測病毒感染的細胞。DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸鹽）細胞核染色后計算細胞的感染率。

用2型PRRSV（美洲株）進行試驗得到了相似的結果，如圖2b所示。結果顯示，愛樂新濃度為0.1 μg/mL時，PRRSV陽性細胞數可減少50 %多，濃度為10 μg/mL時，PRRSV陽性細胞數不及2 %。替米考星濃度為1 μg/mL時，PRRSV陽性細胞數可降低近50 %，泰樂菌素濃度為1 μg/mL時不能抑制病毒的復制。

MA104細胞用抗生素處理后感染2型PRRSV（VR-2332株）。20 h后固定細胞，用間接免疫熒光檢測病毒感染的細胞，DAPI細胞核染色后計算細胞的感染率。

2.2大環內酯類對內體pH值的影響

為了研究愛樂新抗病毒作用的機制，本文研究了愛樂新和其他大環內酯類藥物是否對內體的pH值有影響。使用吖啶橙作為酸性細胞器的指示劑。

MA104細胞中吖啶橙染色的次級內體/溶酶體的平均數如圖3所示。泰樂菌素濃度為100 μg/mL時，吖啶橙染色的次級內體的平均數沒有減少，但培養基中替米考星濃度為1.0 μg/mL時，有輕微減少。0.1 μg/mL的愛樂新導致了酸性內體的數量輕微減少。單個細胞中，呈紅色的次級內體/溶酶體數從73降到了68。相比之下，培養基中愛樂新?的濃度為1.0 μg/mL時可大大減少酸性內體的數量，每個細胞中大約為10（圖4）。

用愛樂新、泰樂菌素、替米考星在特定的濃度下處理MA104細胞4 h。然后用2 μM的吖啶橙處理1 min。將細胞樣品用PBS清洗，放到載玻片上，用共聚焦顯微鏡觀察。吖啶橙染色的細胞呈綠色熒光，酸性細胞器如次級內體/溶酶體呈紅色熒光。按前文提到的方法用大環內酯類處理MA104細胞，然后進行吖啶橙染色。對每個細胞中的紅色熒光細胞器計數，計算每組抗生素在特定濃度下的平均值。

3 討論/結論

結果表明愛樂新可以抑制PRRSV復制，替米考星有一定的效果，而泰樂菌素無效。1型和2型PRRSV均似乎對愛樂新的抑制作用敏感。愛樂新的抗病毒作用對所有的PRRSV毒株均有效，預計在田間大有裨益。

到目前為止，所有的PRRSV已被劃分為1型或2型。但是，1型和2型病毒之間存在巨大的抗原性差異。有文獻報道，歐洲型和北美型病毒主要的表面糖蛋白GP5的氨基酸同源性只有51 %～55 %（Meulenberg，2000）。甚至同一型的毒株變化也很大。例如，東歐和意大利的1型毒株和原型株就存在抗原性差異。這種變異已導致1型疫苗的效果出現問題。最近，中國出現了2型PRRSV的高致病性分離毒株，在其非結構蛋白2上約有30個氨基酸的缺失（Tian等，2007），正在導致嚴重的PRRS的問題，包括大豬的高死亡率。這是迄今為止出現的致病性最高的PRRSV毒株，它的迅速傳播對全球的養豬業是另一個擔憂。已有的2型疫苗無法解決該問題。PRRS是一種具有重要經濟意義的疾病，如果無法找到一個長期有效的解決方案，它可能會造成更大的經濟損失。

有資料表明替米考星有抗病毒的效果（Molitor等，2001；Benfield等，2002），但濃度必須達到400 μg/mL （400 mg/L相當于每噸飼料添加1 600元左右的替米考星）。本研究表明替米考星具有一定的抗病毒效果，但愛樂新表現出更出色的抗病毒作用。吖啶橙結果顯示愛樂新可以提高次級內體/溶酶體的pH值。泰樂菌素不影響內體的pH值，而替米考星可以提高內體的pH值，但是在用于研究病毒感染的長時間孵育后，發現該濃度的替米考星會對細胞產生毒性。

Kreutz和Ackermann （1996）研究證明，在細胞試驗中，PRRSV需要在較低的pH值下進入細胞。Nauwynck等（1999）利用肺泡巨噬細胞對此進行了研究，結果表明PRRSV可以利用網格蛋白介導的吞噬途徑，并依賴較低的pH值環境，這可能有助于病毒的脂質囊膜與內體膜的融合。與其他細胞系相比，病毒進入巨噬細胞較慢，但是基本的復制機制是相同的。

pH值升高可以防止PRRS病毒的囊膜與內體膜融合。這會抑制病毒進入細胞漿，從而抑制病毒復制。應該指出的是，用以提高pH值的愛樂新?的濃度要大于可以減少含有PRRSV細胞的濃度。詳細闡述愛樂新和替米考星的抗病毒作用的機理，還需更多的信息。

以往的研究（Stuart等，2007）對比了這3種大環內酯類抗生素進入各種細胞系的能力，結果顯示愛樂新可以快速進入并在細胞內富集。替米考星可以進入細胞，但速度較慢，而且也達不到相同的濃度。泰樂菌素進入細胞相對較少，并且無法富集。

作為一種RNA病毒，PRRSV的復制發生在細胞漿，3種抗生素的抑制效果依次為：愛樂新>替米考星>泰樂菌素。這很可能和它們進入細胞并在胞內富集的能力有關。

體外研究已證明，愛樂新具有抗病毒效果，可以降低PRRSV在易感細胞的復制，替米考星在一定程度上有效。這是一個很有意思的發現，表明愛樂新可以在田間生產中用以對抗PRRS。眾所周知，PRRSV是豬呼吸道疾病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的一種病原體，其他的主要病原體有肺炎支原體、豬流感、圓環病毒2型。在歐洲和北美洲，這種疾病綜合征可能略有差別（Done和White，2003）。

通過試驗模型研究表明，豬肺炎支原體會加重PRRSV引起的疾病（Thacker等，1999）。同一作者表明，應用抗菌劑（四環素）抑制支原體可以減少PRRSV造成的臨床癥狀（Thacker等，2006）。對PRRS的間接作用可能是其他抗支原體藥物如愛樂新的一個重要方面。下一步將進行體內試驗，用以研究愛樂新對PRRS的直接或間接療效。□□

原題名：Tylvalosin， a macrolide antibiotic， inhibits the in-vitro replication of European and American porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRS） viruses（英文）

原作者：A.D. Stuart，T.D.K. Brown和A.P.A. Mockett（英國劍橋大學病理學系）

參考文獻：（21篇，略）