豬瘟基因工程疫苗研究進展

摘 要：豬瘟作為一種烈性接觸性傳染病嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)。該病無特效治療方法，以預防為主。一些國家已經(jīng)利用我國學者研制的豬瘟兔化弱毒疫苗徹底清除了豬瘟，然而我國卻經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。另外，常規(guī)疫苗免疫與野毒感染尚無法區(qū)分。因此，新型疫苗的研究顯得尤為重要，其中基因工程疫苗成為了研究的熱點領域，包括亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗等。本文對國內外豬瘟基因工程疫苗的研究進展進行了綜述。

關鍵字：豬瘟；疫苗；基因工程；研究進展

中圖分類號：S855.3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）11-0072-02

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever virus，CSFv）引起的，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病之一，以其流行范圍廣、病死率高而備受世界各國關注[1]。目前豬瘟主要分布在亞洲、歐洲、南美洲和遠東的40個國家和地區(qū)[2]。1984年國際OIE組織將其列為A類傳染病，現(xiàn)將其歸為必須報告的傳染病，我國亦將之列為一類動物傳染病[3]。我國學者研制的豬瘟免化弱毒疫苗（也稱C株）對豬瘟預防有著顯著地作用，能有效地預防和清除該疾病。但由于當前豬場免疫計劃不科學、不同廠家生產(chǎn)的疫苗質量存在差距、豬瘟疫苗的生產(chǎn)可能存在牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrheavirus，BVDv）的污染及不同毒力野毒株侵襲豬場引起不同的臨床癥狀等原因導致了近年來豬瘟的流行有逐步上升的趨勢，常常突然暴發(fā)，并以非典型病例為主[4-6]。鑒于常規(guī)豬瘟疫苗的生產(chǎn)工藝、無法區(qū)分野毒感染等局限性，國內外學者更多地投向了基因工程新型疫苗的研發(fā)。常見的基因工程疫苗有亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失苗以及核酸疫苗等，現(xiàn)對以上各種新型疫苗的研究進展情況進行簡要的概述。

1 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗就是應用分子生物學方法從病毒微生物中提取保護性抗原或直接將保護性抗原的編碼基因在體外表達，然后將抗原制成亞單位疫苗。這種疫苗不含有酸，當然也不具有感染性，因而非常安全。由于從病原體內所能提取保護性抗原成分十分有限，因此一般采用抗原基因體外表達的方式制備免疫原。桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)不僅可以高效表達外源蛋白，并且大部分表達的蛋白質都具有較高生化活性，因此該系統(tǒng)常被用于亞單位疫苗研制及生產(chǎn)。Hulst等[7]最早于1993年構建了能夠穩(wěn)定表達CSFv E2蛋白的重組桿狀病毒，并用20 μg～l00 μg純化的E2蛋白制成油包水型疫苗接種試驗豬，結果表明免疫組均能抵抗100LD50的豬瘟強毒（Brescia株）的攻擊，并且該疫苗誘導產(chǎn)生的中和抗體水平遠高于由弱毒疫苗刺激產(chǎn)生的水平。隨后，Moormann等[8]、Smit等[9]及Uttenthal等[10]都進行了CSFv E2蛋白的體外表達及免疫效果的研究，結果均表明豬瘟E2蛋白亞單位疫苗可以有效地預防CSFv的感染。也有研究學者利用酵母表達系統(tǒng)制備CSFv的E2蛋白，并將其制備成疫苗后免疫6周齡的仔豬兩次，經(jīng)攻毒實驗發(fā)現(xiàn)同樣可以刺激機體產(chǎn)生抵抗1×105 TCID50劑量的CSFv攻擊的中和性抗體[11]。另外，由于該種疫苗刺激機體后僅能產(chǎn)生針對E2蛋白的抗體，并不能促使機體產(chǎn)生除該蛋白以外的抗體，所以給區(qū)別疫苗免疫和野毒感染提供了便利條件。目前所建立的區(qū)別診斷方法多以CSFv的E0蛋白為抗原，僅有疫苗免疫的豬只不會產(chǎn)生針對E0的抗體，而野毒感染豬則會產(chǎn)生針對E0的抗體，因此該疫苗還是一種標記性疫苗[12]。然而，該種疫苗也有其不足之處，由于免疫原只有一種，與全病毒相比其免疫原性相對較差、產(chǎn)生保護性抗體的時間較長以及產(chǎn)品研發(fā)費用較高。CSFv E2亞單位疫苗是最早也是目前唯一投入使用的新型標記性疫苗，其商品化產(chǎn)品為德國Bayer公司的CSF marker和荷蘭Intervet公司的Porcilis Pesti。國內尚無商品化的亞單位疫苗，但很多科研單位都在積極地進行研發(fā)工作，有些企業(yè)則有技術引進的想法，例如新疆天康畜牧生物技術股份有限公司與臺灣茂興生物科技有限公司就豬瘟E2亞單位疫苗授權使用進行協(xié)商。

2 基因工程活載體疫苗

2.1 重組活載體疫苗

豬瘟活載體疫苗是將外源目的基因用重組DNA技術克隆到活的載體病毒中制備的一種疫苗，可直接用這種疫苗經(jīng)多種途徑免疫動物。目前研究最多的是痘病毒和偽狂犬病毒，其他作為候選病毒載體還有腺病毒、逆轉錄病毒等。

痘病毒因其具有較廣的宿主譜，較低的毒性，成為了作為生產(chǎn)基因重組疫苗的重要載體之一。Rumenapf等最早將CSFv的E0和E2蛋白的編碼序列克隆到痘苗病毒的TK基因后并成功拯救出穩(wěn)定表達CSFv結構蛋白的重組痘病毒，然后利用該重組病毒免疫試驗豬，結果表明免疫后的豬只均能獲得攻毒保護[13]。Konig等于1995年發(fā)表報道稱其研究小組將CSFv的Npro、E0、El和E2編碼序列分別克隆到痘苗病毒中，并成功拯救出一系列重組病毒，利用這些重組病毒免疫試驗豬后發(fā)現(xiàn)只有表達E0和/或E2蛋白的重組病毒才能夠使豬只獲得攻毒保護，并且證實E2是主要的保護抗原，而E0是次要保護抗原[14]。我國學者李譜華等成功構建了豬瘟E0和E2基因重組雞痘病毒并取得較好的免疫效果[15]。

豬偽狂犬病毒（PseudoRabies virus，PRv）具有遺傳穩(wěn)定、背景清楚、含有高達40 kb與病毒增殖無關的非必需區(qū)可供外源基因插入，使得其成為了一個重要的活病毒表達載體。已證實將CSFv的E2基因序列插入PRv非必須基因內，并不會改變該病毒的生物學特性。van Zjji等最早于1991年發(fā)病論文稱將CSFv的E1蛋白編碼序列插入到PRv構建了減毒活病毒，接種試驗豬后能產(chǎn)生針對PRv及CSFv高水平的中和抗體，并能抵抗PRv及CSFv強毒攻擊[16]。隨后，Peeter等構建了穩(wěn)定表達CSFv E2蛋白的gD/gE雙缺失的重組病毒，并制備疫苗進行免疫攻毒實驗，結果表明重組的活載體疫苗能使免疫豬同時產(chǎn)生針對PRv和CSFv攻毒保護的抗體[17]。

除以上兩種常用活病毒表達載體以外，還有一些可以進行表達外源蛋白的病毒載體，其中包括腺病毒、逆轉錄病毒及口瘡病毒等。2000年Hammond等構建并拯救了表達CSFv E2蛋白的重組腺病毒，以此病毒免疫豬后能夠獲得較理想的攻毒保護效果并且攻毒后未出現(xiàn)任何臨床癥狀及剖檢病變[18]。我國研究學者孫永科等構建了表達CSFv E0或/和E2蛋白的重組腺病毒載體疫苗并取得較好的免疫效果[19-20]；劉建玲等利用逆轉錄病毒作為載體并成功獲得假病毒，最終利用PK-15細胞表達出E2基因用于疫苗研究[21]。

2.2 復合載體疫苗

復合載體疫苗顧名思義就是將不同的載體的優(yōu)點整合在一起，使該病毒載體具有更加有效的特性。仇華吉課題組研究者Sun等構建了由人5型復制缺陷型腺病毒載體和高表達效率的甲病毒組成的復合病毒載體，并以此為基礎成功獲得穩(wěn)定表達CSFv E2蛋白的腺病毒/甲病毒復合載體疫苗。由于該載體同時具備了腺病毒載體的高效轉移外源基因的能力和甲病毒高效表達外源基因及其更強的細胞免疫的能力，使得該載體獲得了更有效的免疫刺激反應。實驗結果表明，以106 TCID50劑量免疫家兔1次后第9天即可產(chǎn)生豬瘟特異性抗體，并且可持續(xù)存在180 d以上。攻毒實驗結果證明所有免疫的家兔都能夠獲得攻毒保護；在豬體以107 TCID50劑量免疫試驗豬兩次后，即可產(chǎn)生有效的體液免疫和細胞免疫應答，攻毒實驗結果證明所有免疫的豬只均能夠獲得攻毒保護，并且未表現(xiàn)任何臨床癥狀及病理剖檢變化[22]。這種將不同載體進行合理化重組的方式能夠最大限度的發(fā)揮不同載體的優(yōu)勢，給活載體疫苗提供了一種新的思路。

2.3 嵌合型重組病毒疫苗

嵌合型重組病毒疫苗是利用基因技術將目的基因插入并同時替換載體中相應基因而構建的重組病毒。從嚴格意義上來講該類疫苗同樣可以歸為重組活載體疫苗，但其載體主要為CSFv同屬的牛傳染性腹瀉病毒（BVDv）或羊邊界病毒（BDv）。2004年Reimann等將CSFv的E2基因替換掉BVDv的E2基因，成功拯救了嵌合型瘟病毒CP7_E2alf[23]。隨后，Koenig等用該嵌合型病毒進行免疫試驗，結果證實該疫苗安全有效[24]。2010年Reimann等又在此嵌合型病毒的基礎上將CP7株BVDv中的E1和E2基因均替換為CSFv對應的基因，構建了另一株嵌合式瘟病毒CP7_E1E2alf_TLA并進行了免疫攻毒實驗。結果顯示低劑量免疫組豬只僅表現(xiàn)為體溫略有升高，并能檢測到較低水平的CSFv基因組序列，而高劑量免疫組則表現(xiàn)較好。目前國內雖未有嵌合型豬瘟疫苗的注冊與生產(chǎn)，但也有學者進行了相關研究。孫永科等利用反向遺傳操作技術，將CSFv強毒石門株基因組不同區(qū)域與非典型豬瘟分離株相應區(qū)域進行替換，構建了一系列有不同生物學特性的感染性克隆，并以此拯救出了穩(wěn)定的毒株，為國內標記疫苗的研究踏出了基礎性的邁步[25]。

病毒活載體疫苗的本質就是雜合病毒，它同時含有兩種甚至多種病毒的基因組信息，并且以載體基因組的轉錄復制元件介導目的蛋白的轉錄與翻譯，從而能夠起到兩種甚至多種疾病的同時防控。PRv以其外源基因載量大、表達效率高、對人無害等優(yōu)點，已逐漸突顯出優(yōu)越的應用前景；痘病毒載體本身可以引起未接種痘苗人群的感染，因而使得痘病毒重組疫苗的應用受到限制；腺病毒可致人感染，潛在的生物安全是限制其作為疫苗載體應用的主要因素。

3 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗的核心點就是尋找病毒復制無關但對病毒毒力相關的基因，通過基因工程技術將該基因敲除掉，拯救出這類毒力降低但復制能力并未衰減的毒株。CSFv基因缺失疫苗就是在該種技術下催生出來的新型基因工程疫苗。

Mayer等分別將CSFv Alfort/187中等毒力株和Eystrup株（強毒株）的Npro基因缺失，結果表明拯救的這兩株缺失病毒毒力大大降低但其復制能力和母本病毒并無差別。免疫攻毒實驗結果證明這兩株基因缺失疫苗均能刺激免疫豬產(chǎn)生可以抵抗致死劑量強毒攻擊的抗體水平[26]。2006年Frey等利用類似的技術將CSFv的E0基因進行缺失并拯救相關病毒，以此為免疫原接種9周齡仔豬，23 d后進行攻毒試驗，同樣證實了該類疫苗安全有效[27]。以上數(shù)據(jù)均顯示基因缺失疫苗因其具有幾乎所有的CSFv抗原表位，但其毒力有得到了大大的降低，為有目的性地構建弱毒疫苗提供了便利的技術。

4 核酸疫苗

核酸疫苗又稱DNA疫苗或基因疫苗，是20世紀90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗。它是將目的蛋白的編碼基因克隆到表達質粒中，然后注入到動物體內，利用宿主細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生目標抗原，進而刺激免疫反應。核酸疫苗與滅活疫苗或亞單位疫苗相比，其不僅能夠刺激體液免疫同時可以刺激細胞免疫反應。另外一次免疫后可以產(chǎn)生終身免疫并能有效地解決母源抗體干擾的問題。但該種疫苗也有其特有的問題亟待解決，如：疫苗的生物安全性。

我國學者余興龍等構建了2個能夠表達CSFv E2蛋白真核表達質粒并轉染BHK21細胞，利用構建的真核表達質粒在豬體上進行免疫攻毒實驗，結果顯示只有一種表達質粒能夠提供100 %的攻毒保護效果，另一種僅提供了部分保護效果[28]。Ganges等將CSFv E1基因的22個氨基酸殘基以及全部的E2基因克隆到真核表達質粒中構建了核酸疫苗并進行豬體免疫攻毒實驗。結果表明在最后一次加強免疫后17 d即可以檢測T細胞反應，并于攻毒后迅速產(chǎn)生體液反應，能夠為免疫豬提供100 %的攻毒保護效果[29]。近來又出現(xiàn)了一種新的核酸疫苗——DNA復制子疫苗。我國學者Li等以甲病毒為載體構建了穩(wěn)定表達CSFv E2蛋白的新型核酸疫苗質粒，利用該質粒進行免疫攻毒實驗，結果表明免疫豬能夠產(chǎn)生特異性抗體并可抵擋CSFv強毒的攻擊[30]。

5 展望

目前疫苗是預防豬瘟最有效的方法，而豬瘟流行情況的復雜性及臨床疾病的非典型性導致了該疾病的預防越來越困難。新型豬瘟疫苗的研究也逐漸成為了當前研究的熱點。隨著新技術的不斷出現(xiàn)，新型豬瘟疫苗的不斷改進，尤其是標記性疫苗的發(fā)展，肯定能夠為養(yǎng)豬業(yè)帶來更安全有效地防治豬瘟的途徑。另外，CSFv的凈化也同樣急需新型標記疫苗的生產(chǎn)及應用。雖然目前大多數(shù)新型豬瘟疫苗的研究仍處于試驗階段，但就目前研究情況來看我們有理由相信不久的將來會有更多安全可靠、使用方便、免疫確實的新型豬瘟疫苗誕生。

參考文獻：（30篇，略）