霉菌毒素吸附劑效果評估的研究

摘 要：大量的研究結果表明，飼料及其原料中不可避免的存在霉菌毒素污染。霉菌毒素已經對畜牧業和人類健康造成嚴重危害，目前最有效、最常用的控制霉菌毒素的方法是在飼料或飼料原料中添加霉菌毒素吸附劑，然而，并非所有的霉菌毒素吸附劑產品都接受了充分的檢驗。因此，迫切需要用科學的方法來評價霉菌毒素吸附劑。本文將對霉菌毒素吸附劑的種類及霉菌毒素吸附劑的效果評價方法進行綜述。

關鍵詞：霉菌毒素；吸附劑；效果評價

中圖分類號：S816 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）10-0066-02

霉菌毒素是霉菌的代謝次生物，普遍存在于飼料及其原料中。目前已知污染飼料的霉菌毒素約有100多種，主要為青霉菌屬、曲霉菌屬和鐮刀菌屬所產的多種霉菌毒素（計成，2007），其中對畜禽危害較大的主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、煙曲霉毒素、單端孢毒素和玉米赤霉烯酮等。世界上至少有25 %的谷物受到霉菌毒素的污染，對飼料業、畜牧業和人類健康造成嚴重危害。

國內外許多研究者對如何消除霉菌毒素對畜禽健康和生產性能的不良影響、降低霉菌毒素及其代謝產物在畜產品中的殘留、保證畜產品安全等方面作了大量研究。在生產實踐中，霉菌無法完全消除。使用防霉劑雖可有效防止飼料霉變，但不能降低已存在于飼料中的霉菌毒素含量（王若軍，2003），且膨化制粒等處理工藝也并不能達到降解霉菌毒素的目的。從技術角度考慮，目前不可能存在真正意義上的霉菌毒素降解劑或裂解劑。鑒于此，飼料中添加霉菌毒素吸附劑是降低霉菌毒素危害、提高動物生產性能的有效手段。目前，市場上的霉菌毒素吸附劑有活性炭、鋁硅酸鹽類、有機物類（如酵母細胞壁等）及其它樹脂類（如消膽胺等），主要以黏土類（氫氧化硅鋁酸鈉鈣，HSCAS）和寡聚糖類（酵母細胞提取物）為基礎，通過采用不同加工工藝處理，以增強產品對各種霉菌毒素的吸附能力。但歸根結底，黏土類仍然以吸附黃曲霉毒素為主，而寡聚糖類主要對嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮吸附效果較為明顯。

雖然霉菌毒素對畜牧生產危害甚大，但國內有關體外快速霉菌毒素吸附劑的相關研究報道很少，而且主要局限于黃曲霉毒素B1（葉盛群，2012）。本文收集一些對霉菌毒素吸附劑的相關評估方法如下：

1 體外實驗評價

因為體內實驗成本高，工作量大，在進行體內實驗之前，人們往往用體外實驗證明吸附劑的吸附效果，體外試驗在證明一種吸附劑對某種毒素不具有吸附力上很有用。如果一種物質在體外不能吸附某種毒素，那么很可能在體內也是如此。如果想評價多種不同來源的樣品作為吸附劑的可能性，體外試驗作為第一步檢驗是非常有價值的。

馬學會（2011）在pH 3.0檸檬酸緩沖液和pH 6.5磷酸氫鈉緩沖液配制霉菌毒素反應液，反應液中霉菌毒素含量：200 μg/L黃曲霉毒素B1、2 mg/L玉米赤霉烯酮、50 mg/L嘔吐毒素、200 μg/L赭曲霉素、2 mg/L煙曲霉毒素Bl。吸附試驗原理：試管中稱取一定量的吸附劑樣品，加入[按0.1 %（w/v）比例]預先已配制的反應液（含有所要求的標準霉菌毒素濃度），37 ℃下震動培養1.5 h后離心。取離心后的上層清液，用高效液相色譜儀測定其中所含不同霉菌毒素的濃度，從而計算出吸附劑產品的吸附率。吸附試驗步驟：（1）分別在不同吸附劑樣品中加入10 mL霉菌毒素標準緩沖液，并預留2支試管用于霉菌毒素標準緩沖液空白組（不含吸附劑）；（2）將試管在37 ℃水浴恒溫振蕩器中震蕩1.5 h，震蕩過程中確定試管被固定；（3）用離心機在2 000 rpm/min下離心10 min后，小心移取上清液200 μL（避免下層混濁物帶入上述液體），然后加入5 mL流動相，混合均勻后裝入進樣瓶，取樣100 μL，通過高壓液相色譜法（HPLC）進行分析。

1.1 ELISA法吸附

稱取50 mg霉菌毒素吸附劑樣品于試管中，加入 10 mL pH3.0霉菌毒素工作液，體系中霉菌毒素吸附劑的添加量為5 mg/mL。空白對照為不添加任何霉菌毒素吸附劑的 10 mL pH3.0霉菌毒素工作液。將試管放在37 ℃恒溫振蕩器上，震蕩1 h。反應結束后于3 500 r/min離心10 min，測定上清液中的霉菌毒素含量。

1.2 解吸附試驗

上述試驗結束后，傾去離心管中上清液，在剩余物中加入10 mL pH6.8磷酸鹽緩沖液，37 ℃恒溫震蕩1 h。反應結束后于3 500 r/min離心10 min，測定上清液中剩余的霉菌毒素含量。數據處理：根據檢測毒素的含量，按下列公式計算霉菌毒素吸附劑的吸附效率。

Y=100×（A-B-C）/A

上式中：Y表示霉菌毒素吸附劑對霉菌毒素的吸附效率；A表示空白對照組（即霉菌毒素工作液中不加吸附劑）含量；B表示吸附試驗中上清液中霉菌毒素的含量；C表示解吸附試驗中上清液中霉菌毒素的含量。

涂威（2011）等報道，體外方法能直觀評價吸附劑對霉菌毒素的吸附性能，作為一個初步評價手段，主要起到“篩選”吸附劑的作用。通常按照下列步驟進行：

（1）吸附試驗：① 配制一定量的霉菌毒素標準溶液，并加入待測的一定量的吸附劑；② 設定溶液pH和溫度，搖床振蕩一定時間，然后在一定轉速下離心；③ 高效液相色譜法測定上清液中霉菌毒素的含量。同時設置未添加吸附劑的對照組以消除試驗過程中霉菌毒素的非特異性吸附，按照實驗需要每個對照組設置多個重復。按下式計算吸附量q（ng/mg）和吸附率Y（%）：

q=V（Co-C）/m （1）

Y=100（Co-C）/Co （2）

其中：v—溶液的體積（mL）；m—吸附劑的用量（mg）：CO、C—吸附前后霉菌毒素的濃度（ng/mL）。

（2）解吸試驗：吸附反應結束后，傾去離心管上清液，殘余物中加入一定量的水溶液，搖床振蕩解吸，然后在一定轉速下離心（水溶液pH，溫度，搖床振蕩時間，離心轉速及時間與吸附實驗相同）高效液相色譜法測定上清液中霉菌毒素的含量，經殘液校正后，計算解吸量及解吸率。通常吸附率越高，解吸率越低的吸附劑應用前景最好。在驗證某種吸附劑的最佳吸附條件時，我們還應設置不同的振蕩時間，不同的吸附劑用量，溫度、pH梯度等。

2 體內實驗評價

體外試驗不能完全模擬動物體內具有復雜酶活性、pH 值劇烈波動等特點的消化道環境。不能充分說明吸附劑對霉菌毒素的結合效果，需要與動物試驗相結合，更合理的評價吸附劑的安全性和作用效果。因此在經過體外實驗后，對有希望的樣品必須進一步用體內試驗進行檢驗。

首先進行飼養實驗，為了確證一種吸附劑的有效性，以下4種試驗處理是必不可少的：

① 日糧1：對照日糧，不含霉菌毒素和吸附劑；

② 日糧2：含有霉菌毒素的日糧1；

③ 日糧3：含有吸附劑的日糧1；

④ 日糧4：含有吸附劑的日糧2（含有霉菌毒素）。霉菌毒素的作用之一是降低動物采食量，抑制動物生長。霉菌毒素能降低某些消化酶類的活性，使一些營養成分的吸收受阻，影響動物生長。

因此，我們可以通過測定動物的生理生化指標來說明吸附劑對霉菌毒素的吸附程度，最常見的測定指標是實驗動物的日增重（ADG）、采食量（FI）和料重比（F/G），為了對霉菌毒素吸附劑作出更深入的評價，我們還應測定其他生理生化指標：器官相對重量、免疫器官指數、血清、器官和組織中霉菌毒素的殘留量、血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、尿酸（UA）、谷草轉氨酶（GOT）、谷丙轉氨酶（GPT）、淀粉酶（AMY）、堿性磷酸酶（ALP）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）。這些指標可用試劑盒通過全自動（或半自動）生化分析儀測定。如果吸附劑對霉菌毒素的吸附效果良好，那么這些生理生化指標也趨近于正常值。

3 霉菌毒素吸附劑對營養物質的影響

不同霉菌毒素的分子結構相差甚遠，從這種意義上來說，它們與維生素相似，而不同于結構都相似的蛋白質。因此，可以假定霉菌毒素吸附劑在吸附霉菌毒素的同時，可能與飼料中的約40多種維生素、微量元素、礦物質、必需氨基酸等營養成分或藥劑的一種或幾種結合，干擾營養物質及藥物的利用。谷巍等（2010）研究表明，霉菌毒素吸附劑具有對維生素的非選擇性吸附和被維生素所飽和而喪失對毒素的吸附能力。所以在鑒別一種吸附劑是否適用時，必須考慮它對飼料中營養成分及藥物的影響。在鑒定霉菌毒素吸附劑對營養成分及藥物的吸附時，我們要針對每一種吸附劑進行吸附試驗和解吸試驗。在試驗的同時我們可以根據實際需要設置相應的溫度，pH梯度。通過對吸附試驗和解吸試驗結果的分析我們可以得出吸附劑對營養物質和藥物的吸附能力。如果某種吸附劑對飼料中有效成分的吸附強而解吸少，在實際應用中我們應盡可能的減少其在飼料中的添加量。該吸附劑的添加將使飼料營養有效性降低，所以應考慮各種營養成分補充平衡問題。

4 小結

結果表明，消除霉菌毒素污染最實際、有效的方法是在飼料中添加吸附劑，吸附劑在體內結合霉菌毒素形成復合物，使毒素經過消化道時不被吸收，直接隨著吸附劑排出體外。對其吸附能力和吸附特異性的研究證實，這些吸附劑能不同程度的清除霉菌毒素。然而，在使用過程中均存在一定缺陷，主要是：（1）吸附功能單一，不能同時吸附飼料中存在的多種不同類型的霉菌毒素；（2）添加量大，占用過大配方空問；（3）吸附霉菌毒素的同時，與飼料中的維生素、礦物質等營養成分結合，干擾營養物質利用；（4）可能含有二噁英和其他污染物，在一定程度上污染飼料。存在的這些缺陷都是評定霉菌毒素吸附劑有效性的依據。

影響霉菌毒素吸附劑效果的因素有很多，如：吸附劑本身的結構和特性，霉菌毒素的分子結構及其理化特性，飼料原料的霉變程度，吸附劑的添加量、實驗方法以及霉菌毒素的檢測方法等。因此不同霉菌毒素吸附劑對同一霉菌毒素的吸附效率不同，霉菌毒素吸附劑的晶體結構和物理特性，包括總電荷量、電荷的分布、空隙的大小以及比表面積，是影響吸附效果的主要原因之一。同一霉菌毒素吸附劑對不同的霉菌毒素的吸附效率也不同，不同種類的霉菌毒素由于其分子大小、分子結構以及分子極性等理化性質的不同，從而導致同一種霉菌毒素吸附劑對不同的霉菌毒素吸附效率不同。如：黃曲霉毒素B1分子量312，其結構中含有1個雙呋喃環和1個氧雜萘鄰酮，二呋喃環的末端有雙鍵者，是一種極性很強的分子。玉米赤霉烯酮分子量318，其結構中含有2個酚羥基的內酯，溶于水，只有在堿性溶液中酯鍵才能打開，從而是一種雙極性或弱極性的分子。因此導致同一種霉菌毒素吸附劑對黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效率不同。控制霉菌毒素最簡便易行的方法是添加吸附劑，但從現有的研究來看，不同霉菌毒素分子的理化性質差異較大，而且針對不同霉菌毒素的吸附劑種類繁多。為了降低霉菌毒素對動物和人類造成的危害，除了對霉菌毒素吸附劑進行研究外，建立一種快速、靈敏、易行的效果評價方法是飼料業對霉菌毒素吸附劑制定標準以及確保飼料安全的重要途徑。□□

參考文獻：（6篇，略）