遺傳變異與疫苗免疫、發病機理及診斷的關系（續）豬圓環病毒2型（PCV2）：

上期回顧：上一期主要介紹了PCV2分離株的分子差異與PCV2的致病性，包括豬圓環病毒間致病差異、ORF1和ORF2對致病性的影響、CP內的抗體表位、PCV2基因型間的抗原性差異。

關鍵詞：關鍵詞：PCV2；PCV2致病機理；PCV2遺傳變異

中圖分類號：S852 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2014）10-0070-02

注：目前國內的洛陽普萊柯、黑龍江的哈維科、四川的成都天邦等公司均有可預防PCV2感染的商品疫苗。

3 遺傳變異在診斷中的作用

3.1 PCV1和PCV2的鑒別診斷

PCV和PCVAD的標準診斷方法已經廣泛綜述（Gillesipe等，2009；Opriessing等，2007）。PCV1和PCV2特異性的兼并引物可以用于聚合酶鏈式反應（PCR）或原位雜交來鑒別PCV1和PCV2（Larochelle等，1999；Ouaradni等，1999；Kim和Chae，2002）。另一個方法是PCR擴增結合限制性片段長度多態性分析（RFLP）。（Fenaux等，2000）。還有報道的是PCV1和PCV2特異性單克隆抗體，它可以用于基于抗體的實驗，如間接免疫熒光（IFA），免疫組織化學（IHC）和抗原捕獲酶聯免疫吸附實驗（ELISA；Allan和Ellis，2000）。最終還有檢測PCV1和PCV2特異抗體的方法，包括IFA和ELISA（Allan和Ellis，2000；Blanchard等，2003）。

3.2 PCV2a和PCV2b的鑒別

第一個用于快速鑒別PCV2a和PCV2b的方法是RFLP圖譜（Wen等，2005；Carman等，2008）。最早在北美鑒定PCV2b基因型使用的方法就是RFLP（Carman等，2008）。該分析使用PCR擴增包含完整ORF2的902 bp片段。PCR產物用XbaI、EcoRI和SmaI在獨立反應中酶切，產生的422 bp目的片段鑒定為PCV2a，431 bp鑒定為PCV2b。快速區分PCV2a和PCV2b基因型的方法基于PCR，使用的是ORF2中基因型特異性標簽序列（在第三部分描述；Cheung等，2007）。然而，因為標簽基序中微小的序列差異，探針與基因型特異標簽雜交經常失敗。另一種替代性的基于TaqMan分析，由Kansas州立獸醫診斷實驗室（KSVDL）提供，該方法基于ORF1中872位單核苷酸變化。在這一位點PCV2a為C而PCV2b為T。即使這是在第三個密碼子單一突變，可以區分2a和2b。目前還沒有能夠區別PCV2基因型的抗體分析 方法。

4 疫苗和免疫

4.1 PCV2疫苗的有效性

第一個商業化的二劑量桿狀病毒表達CP的疫苗（Intervet）于2006年在一個小的仔豬圈進行測試，來完成Kensas PRRSV陰性農場的建設（Horlen等，2008）。該農場在2005年末暴發了嚴重的PCVAD，同時群體中產生了PCV2b。與對照組相比，接種疫苗豬死亡率下降，病毒血癥降低。此外，免疫豬在運送到市場時體重更高（圖4）。該研究證實基于PCV2a的疫苗可以在野外保護PCV2b感染。此外，這是第一個報道的可以減少增重的PCVAD。更多的野外和實驗室研究證實這一發現（Fachinger等，2008；Fort等，2008，2009；Kixmoller等，2008；Martelli等，2011；Opriessin等，2008a，2011，2009）。

目前，基于表達PCV2a的ORF2抗原，有四種商業化疫苗在野外使用。Circumvent PCV和Ingelvac CircoFLEX由桿狀病毒表達PCV2的CP組成，分別為兩倍或單倍劑量使用。第三種疫苗Fostera PCV2為包含PCV1骨架，表達PCV2的ORF2的滅活全病毒。第四種Circovac將滅活全PCV2a作為抗原 *。目前沒有證據表明PCV2b的CP抗原同時使用會現在的疫苗提供更有效的保護。

最近實驗室疫苗研究將外源標簽作為陽性篩選標記（Beach等，2011；Huang等，2011）。這些疫苗允許鑒別免疫動物和感染動物（DIVA）檢測方法的發展。

4.2 疫苗接種后抗病毒宿主免疫

PCVAD的一個特征是PCV2可以調節宿主的免疫反應。比如，PMWS表現為完全喪失淋巴細胞（Chae，2004）。其它極端情況，如PDNS豬產生超免反應，包括產生大量PCV2特異抗體，導致免疫復合物形成和疾病發生（Wellenberg等，2004）。

為了解PCV2調節宿主免疫的機制，我們用實驗感染、疫苗免疫和臨床患病豬的血清，來鑒定CP識別的功能域（Trible等，2011）。疫苗免疫誘導的抗體識別最大的肽段CP（43～233）。相比之下PDNS豬產生的抗體識別最小肽段區域，其中包括一個免疫決定功能域169-STIDYFQPNNKR-180。CP（169～180）功能域位于C表位，在所有PCV2分離株中高度保守。在免疫和PCV2感染豬中還發現抗體反應存在差異。雖然疫苗接種和感染豬都有相似水平的PCV2特異性抗體，但是疫苗接種會使PCV2中和活性上升4倍（圖5）。這些結果表明CP（169～180）可能作為誘餌，轉移體液免疫遠離保護性表位。一個可能的解釋是抗體的可接近性和單體的免疫原性與CP的多聚體對抗。前面討論到Khayat等，（2011）解決了CP的晶體結構，其單體形式包括一個暴露的莖環加工CP（169～180），它埋在VLP中。此外桿狀病毒表達的CP可以組裝成病毒樣顆粒（Khayat等，2011）.

實驗性攻毒實驗進一步證實這一現象（文章準備中）。大腸桿菌或桿狀病毒表達的CP（單體43～233位）免疫豬。免疫桿狀病毒表達蛋白誘導高水平的抗CP（43～233）抗體和低水平的抗CP抗體（169～180）。PCV2攻毒后，免疫桿狀病毒表達的VLP組血清中檢測不到病毒。免疫CP（43～233）單體可以誘導高水平的抗CP（43～233）和對CP（160～180）的高反應性。CP單體免疫豬的病毒血癥與未免疫PCV2攻毒株相似（未顯示數據）圖6。我們提出保護性抗體來自PCV2 VLP形成的表位，CP單體表位產生非保護性抗體。針對卷曲表位的抗體在PCVAD的發展中發揮重要作用。因為卷曲抗體在所有PCV2分離株中高度保守，該模型預測PCV2a和PCV2b引起的疾病應該沒有差異。

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（未完，待續）