桂林貓兒山蘇云金芽孢桿菌的篩選及抑菌性研究

摘要[目的]探明桂林市貓兒山風(fēng)景區(qū)Bt的多樣性和分布概況。[方法]在該景區(qū)海拔1 800 ～2 000 m的常綠針闊葉林和海拔2 000 m以上的灌叢矮林采集土壤樣品共1 168份，分離Bt菌株，并對(duì)Bt分離株進(jìn)行伴孢晶體蛋白分子量的測(cè)定和發(fā)酵上清液抑菌性分析。[結(jié)果]從該景區(qū)針闊葉林和灌叢矮林的146個(gè)樣點(diǎn)共篩選出44個(gè)Bt菌株，出菌率達(dá)30.14%；其中14株Bt菌株均表達(dá)120 kD的蛋白，12株表達(dá)66 kD的蛋白。將14株Bt分離株的發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌檢測(cè)，僅有4株對(duì)草生歐文氏桿菌有抑制效果，其中9號(hào)的Bt分離株抑制率最高。9號(hào)Bt分離株發(fā)酵液上清的抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性研究結(jié)果表明抑菌物質(zhì)在65 ℃下2 h內(nèi)不失活，其至少含有2種抑菌物質(zhì)。[結(jié)論]為豐富我國(guó)西部地區(qū)Bt資源的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 蘇云金芽孢桿菌；SDSPAGE；伴孢晶體；抑菌

中圖分類號(hào)S481文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）30-10561-03

基金項(xiàng)目廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心資助項(xiàng)目（KH2013YB013）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFBA118134）；廣西壯藥產(chǎn)業(yè)化工程院科研項(xiàng)目（2014GXZYCYH03）。

作者簡(jiǎn)介李霞（1981- ），女，黑龍江肇東人，講師，博士，從事天然化學(xué)產(chǎn)物活性研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事天然化學(xué)產(chǎn)物活性的研究。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， 簡(jiǎn)稱Bt），化能異養(yǎng)型革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其利用的碳源主要為單糖和淀粉[1]。Bt主要特點(diǎn)是能產(chǎn)生特異性毒殺作用的伴孢晶體（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs），迄今Bt的殺蟲(chóng)活性譜已經(jīng)擴(kuò)大到無(wú)脊椎動(dòng)物4個(gè)門及節(jié)肢動(dòng)物中9個(gè)目的動(dòng)物[2]。Bt在發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生可溶性的抗生素（Zwittermicin A， 簡(jiǎn)稱ZwA）[3]，能抑制多種微生物的生長(zhǎng)，與Bt伴孢晶體混用時(shí)具有很高的增效作用[4-5]。目前Bt制劑已成為全球用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物類殺蟲(chóng)劑，具估計(jì)目前全世界分離保存的Bt菌株已達(dá)4萬(wàn)多株[6]。伴隨著B(niǎo)t制劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，害蟲(chóng)也隨之逐漸產(chǎn)生抗性。因此，對(duì)我國(guó)境內(nèi)Bt菌株進(jìn)行分離和研究，發(fā)掘新型Bt基因，尋找具有廣譜殺蟲(chóng)性質(zhì)的Bt，具有廣闊的商業(yè)前景和科研價(jià)值。

Bt菌株廣泛分布于自然界，不同地域中表現(xiàn)出來(lái)的特性也有所區(qū)別。貓兒山風(fēng)景區(qū)位于廣西東北部，海拔高度2 141.5 m，森林覆蓋率達(dá)96.5%，常綠針闊葉林，土壤肥沃，植被豐富，水源豐沛，適合于土壤微生物的生存；灌叢矮林，晝夜溫差懸殊，日照充足，適于抗性強(qiáng)的微生物生存。為了探明該地區(qū)Bt的多樣性和分布概況，在該地區(qū)海拔1 800～2 000 m的常綠針闊葉林和海拔2 000 m以上的灌叢矮林[7]采集土壤樣品共1 168份，分離Bt菌株，并對(duì)Bt分離株進(jìn)行了伴孢晶體蛋白分子量的測(cè)定和分離株的發(fā)酵上清液抑菌性分析，旨在為豐富我國(guó)西部地區(qū)Bt資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。Bt庫(kù)斯塔克亞種菌株HD1（簡(jiǎn)稱HD1）和草生歐文氏桿菌（Erwinia herbicola LS005）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2試劑。石炭酸復(fù)紅染液：2 g堿性品紅溶于20 ml含5%苯酚的酒精，使用時(shí)稀釋15倍。

1.1.3培養(yǎng)基。1/2LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.50%，酵母粉0.25%，氯化鈉0.50%，瓊脂粉1.50%。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.000 0%，蛋白胨2.000 0%，無(wú)水氯化鈣0.080 0%，磷酸氫二鉀0.130 0%，硫酸鎂0.020 0%，硫酸錳0.000 8%，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

1.2方法

1.2.1土樣采集。使用經(jīng)緯儀，以經(jīng)緯度為坐標(biāo)圓點(diǎn)，在半徑為5 m的范圍內(nèi)隨機(jī)采集8份土壤樣品，選取植被豐富、潮濕、避免陽(yáng)光直射的腐殖層，采集腐殖層下5～15 cm的土壤，裝入無(wú)菌的自封袋中，記錄坐標(biāo)圓點(diǎn)的經(jīng)緯度和海拔。

1.2.2Bt菌株分離。坐標(biāo)點(diǎn)的8份土壤中，每份取2 g混于15 ml離心管中，加入無(wú)菌玻璃珠和無(wú)菌水至離心管刻度15 ml處，使用旋窩混合器振蕩混勻，置于80 ℃水浴20 min。取上清液稀釋成10-2和10-4 2個(gè)梯度，吸取100 μl于1/2LB固體培養(yǎng)基中均勻涂布，30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)40～50 h。

1.2.3Bt菌株鑒定。觀察菌落在1/2 LB固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，挑選菌落顏色為乳白色、形態(tài)呈圓形、邊緣呈鋸齒形的菌株進(jìn)行制片。使用石炭酸復(fù)紅染液對(duì)涂菌部位染色5 min，隨后自來(lái)水沖洗至洗液為無(wú)色，晾干，100倍油鏡觀察伴孢晶體的有無(wú)及伴孢晶體的形態(tài)，計(jì)算出菌率。

出菌率=Bt分離株數(shù)量/采樣坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)目

1.2.4Bt分離株伴孢晶體SDSPAGE分析。將Bt分離株接種于1/2 LB固體培養(yǎng)基中劃線，30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)至Bt伴孢晶體釋放。刮取2 mg左右菌株制備SDSPAGE待測(cè)液，待測(cè)液制備和SDSPAGE分析參見(jiàn)文獻(xiàn)[8-9]。將凝膠圖片使用軟件“UVITec”處理，直接得到蛋白分子量數(shù)據(jù)。

1.2.5Bt分離株發(fā)酵液上清抑菌效果檢測(cè)。將Bt分離株于1/2 LB液體培養(yǎng)基中30 ℃恒溫?fù)u床活化18 h，以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵培養(yǎng)液，4 500 r/min離心15 min，上清液作為待測(cè)液。使用草生歐文氏桿菌作為指示菌，對(duì)Bt分離株進(jìn)行伴孢晶體的SDSPAGE電泳分析，采用牛津杯法[10]觀察Bt分離株發(fā)酵液上清對(duì)其抑制的效果。以HD1為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)酵液為陰性對(duì)照，將Bt分離株發(fā)酵液上清于95 ℃水浴2 h，以室溫下Bt分離株發(fā)酵液上清作為對(duì)比進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。測(cè)量每個(gè)孔徑抑菌圈的大小，計(jì)算各待測(cè)液與Bt菌株HD1抑菌圈直徑和直徑比值。

抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-抑菌圈內(nèi)徑

直徑比值=待測(cè)液抑菌圈直徑/HD1抑菌圈直徑

1.2.6Bt分離菌發(fā)酵液上清中抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性研究。使用比HD1抑制草生歐文氏桿菌效果好的Bt分離株，將分離株發(fā)酵液上清以65、80、95 ℃分別水浴加熱15、30、45、60、75、90、105、120 min。使用草生歐文氏桿菌作為指示菌，采用牛津杯法[10]，觀察其抑制效果。以水浴時(shí)間為橫坐標(biāo)（x），抑菌直徑為縱坐標(biāo)（y），繪制回歸曲線。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離貓兒山景區(qū)共設(shè)146個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，采集1 168份土壤，分離鑒定出Bt菌株44株，出菌率為30.14%；針闊葉林設(shè)定127個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，采集1 016份土壤，共分離鑒定出Bt菌株41株；灌叢矮林19個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，采集152份土壤，共分離鑒定出Bt菌株3株（表1）。針闊葉林的出菌率（3228%）遠(yuǎn)高于灌叢矮林（15.79%），其原因可能灌叢矮林帶與針闊葉林帶相比海拔較高，日照較強(qiáng)，土壤濕度較低，腐殖層較薄。

2.2菌株形態(tài)和伴孢晶體形態(tài)觀察于光學(xué)顯微鏡100倍油鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)41株Bt分離株的伴孢晶體均為菱形（圖1），未發(fā)現(xiàn)其他形態(tài)的伴孢晶體。其原因可能為貓兒山地區(qū)土壤中的Bt的伴孢晶體均為菱形。注：a.伴孢晶體； b.芽孢； c.營(yíng)養(yǎng)體。

2.3晶體蛋白的SDSPAGE分析分離出Bt的14個(gè)采樣坐標(biāo)點(diǎn)，每坐標(biāo)隨機(jī)取1株Bt分離株進(jìn)行伴孢晶體的SDSPAGE電泳分析，共取14株Bt分離菌株（表2）。14株Bt的伴孢晶體均表達(dá)了120 kD的蛋白，12株Bt的伴孢晶體表達(dá)了66 kD的蛋白，預(yù)測(cè)貓兒山的Bt菌株伴孢晶體均含120 kD的蛋白，絕大部分含有66 kD的蛋白。14株Bt分離株中，5株表達(dá)了3種分子量，3株表達(dá)5種分子量，3株表達(dá)4種分子量，2株表達(dá)7種分子量，1株表達(dá)9種分子量。其中2號(hào)Bt分離株表達(dá)了9種分子量，該菌株可能為含有新型Bt基因的野生菌株，需要進(jìn)一步研究。

2.4Bt分離株發(fā)酵液上清抑菌效果將14株Bt分離株的發(fā)酵液上清，以草生歐文氏桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌效果檢

2.5Bt分離菌發(fā)酵液上清中抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性使用9號(hào)Bt分離株發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性研究，繪制熱穩(wěn)定性的回歸曲線（圖2）。65 ℃水浴15～120 min的抑菌率區(qū)域穩(wěn)定，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)在65 ℃下2 h以內(nèi)不失活；80 ℃水浴15～120 min的抑菌率波動(dòng)性較大，推測(cè)抑菌活性物質(zhì)在該溫度2 h內(nèi)既有增強(qiáng)也有減弱；95 ℃水浴60 min后區(qū)域穩(wěn)定，推測(cè)至少含有2種抑菌物質(zhì)。

3結(jié)論

從桂林市貓兒山景區(qū)針闊葉林和灌叢矮林的146個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)的土壤中共篩選出44株Bt，進(jìn)一步豐富了我國(guó)西部地區(qū)的Bt資源庫(kù)；14株Bt分離株所表達(dá)的蛋白呈現(xiàn)的多元化顯示了貓兒山景區(qū)Bt的多樣性，9號(hào)Bt對(duì)草生歐文氏桿菌的高抑制率以及其抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和多元性，值得進(jìn)表3Bt分離株發(fā)酵液上清抑菌效果

參考文獻(xiàn)

[1] 王利平， 代林遠(yuǎn)， 李鵬.蘇云金芽孢桿菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2011， 38（9）： 224-227.

[2] 喻子牛， 孫明， 劉子鐸.蘇云金芽孢桿菌的分類及生物活性蛋白基因[J].中國(guó)生物防治， 1996（12）： 89-89.

[3] SILOSUH L A，LETHBRIDGE B J，RAFFEL L A，et al.Biological activities of two fungistatic antibiotic produced by Bacillus cereus UW85[J].Applied and Environmental Microbiology， 1994，60：2023-2030.

[4] MANKER D C，LIDSTER W D，STAMES R L，et al.Synergy between Zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki against gypsy moth （Lepidopteria： Lyman triidae）[J].Biological Control， 2000， 29（1）： 101-107.