大蒜渣中多酚物質(zhì)的提取研究

摘要[目的]對(duì)大蒜渣中的多酚物質(zhì)進(jìn)行提取研究，以提高大蒜的資源利用率。[方法] 以大蒜渣為材料，對(duì)其中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)溶劑濃度、提取溫度、時(shí)間、料液比4個(gè)單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，并采用酒石酸亞鐵分光光度法測定了總酚含量。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，大蒜渣中多酚物質(zhì)提取的適宜工藝條件為乙醇濃度 65%，溫度 50 ℃，時(shí)間 70 min，料液比 1∶20 g/ml，該類大蒜渣多酚粗提液具有一定的還原能力，為一類有開發(fā)價(jià)值的天然產(chǎn)物。[結(jié)論] 研究可為促進(jìn)大蒜渣中活性成分的開發(fā)利用和大蒜深加工技術(shù)的應(yīng)用，提升大蒜的資源利用率、加大農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用研究提供參考。

關(guān)鍵詞 大蒜渣；多酚類物質(zhì)；提取

中圖分類號(hào)S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）30-10669-04

作者簡介李浩（1990- ），男，安徽岳西人，本科生，專業(yè)：應(yīng)用生物科學(xué)。*通訊作者，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事生物化學(xué)研究。

大蒜，百合科蔥屬植物，有“土里長出的青霉素”的美稱[1]。現(xiàn)已證實(shí)，大蒜的主要醫(yī)用成分是二烯丙基三硫化物（即大蒜新素），其具有抗菌消炎、抗癌、降壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[2]。大蒜還含有人體所必需的多種微量元素（如硒、鍺、鋅等）、維生素和氨基酸等。近年來，國際上對(duì)大蒜油的需求不斷增加，故產(chǎn)生了大量的蒜渣。研究表明，蒸餾法提取大蒜油后的剩余蒜渣（約占大蒜總重量的99.5%左右）均被遺棄掉，這不僅造成了資源的極大浪費(fèi)，且由于蒜渣具有較強(qiáng)的刺激性臭味，嚴(yán)重污染了環(huán)境[3]。因此，對(duì)大蒜渣的開發(fā)利用迫在眉睫。已有研究結(jié)果表明，提取大蒜油后的大蒜渣含有人體所必需的礦物質(zhì)、多種維生素、17種氨基酸及微量元素硒、鍺、碘、鋅和SOD（超氧化物歧化酶），還有少量大蒜素，具有很強(qiáng)的抗菌、消炎、降血壓、降血脂能力，對(duì)動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、血栓癥、糖尿病有非常好的療效，且有抗病毒、抑制血小板凝聚、防治癌癥和腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老等功效，有很高的開發(fā)利用價(jià)值，并具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[1-3]。

植物多酚類化合物是一類具有多個(gè)酚羥基化合物的總稱，是植物體內(nèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物。植物多酚具有很強(qiáng)的抗氧化性能和明顯的抑菌、抗病毒、抗癌、抗老化以及抑制膽固醇上升等作用[4-5]。因其獨(dú)特的功能活性，植物多酚已經(jīng)被大量應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、皮革、食品以及日用化工等相關(guān)領(lǐng)域，且發(fā)揮出不可代替的功用。同時(shí)，伴隨著天然產(chǎn)物開發(fā)利用的不斷興起，植物多酚類化合物已成為研究天然產(chǎn)物和有機(jī)化學(xué)的重點(diǎn)，國內(nèi)外科研學(xué)者紛紛從不同角度和領(lǐng)域?qū)χ参锒喾诱归_了廣泛而深入的科研工作。

筆者以大蒜渣為材料，對(duì)其中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，探索大蒜渣的開發(fā)途徑，以促進(jìn)大蒜渣中活性成分的開發(fā)利用和大蒜深加工技術(shù)的應(yīng)用，為提升大蒜的資源利用率、加大農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料大蒜，購于合肥市菜市場；焦性沒食子酸、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、乙醇、丙酮等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理。取大蒜約200 g，剝皮，自來水浸泡20～30 min。將浸泡過的大蒜放在組織搗碎機(jī)中，加水至剛好漫過大蒜，充分搗碎。將搗碎后的蒜渣倒入圓底燒瓶，加入約等體積的水，置于水浴鍋中水浴處理（50 ℃水浴2 h或者55 ℃水浴4 h）。電熱套上加熱，以水蒸汽進(jìn)行蒸餾1～3 h不等，加熱過程中可見黃色大蒜精油被蒸餾出，當(dāng)觀察不到精油繼續(xù)餾出時(shí)即可停止加熱（加熱時(shí)間約為1 h）。稍冷卻后用4層紗布過濾，即為蒜渣。稍擰干，均勻平鋪于白瓷盤上，于50 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行薄層干燥，直至恒重為止[6]。粉碎機(jī)粉碎，備用。

1.2.2單因素試驗(yàn)。

1.2.2.1溶劑種類的選擇。在料液比1∶10 g/ml，固定的提取溫度為30 ℃和提取時(shí)間為60 min的條件下，分別用60%甲醇、60%乙醇和蒸餾水提取，比較不同溶劑對(duì)提取液中大蒜渣中多酚含量的影響，選擇適合用于大蒜渣多酚物質(zhì)提取的溶劑。

1.2.2.2溶劑濃度對(duì)多酚提取的影響。固定提取溫度為30 ℃、料液比1∶10 g/ml、提取時(shí)間60 min，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇對(duì)大蒜渣多酚物質(zhì)進(jìn)行提取，分析乙醇濃度對(duì)大蒜渣多酚物質(zhì)提取效果的影響。

1.2.2.3提取時(shí)間對(duì)多酚提取的影響。以60%的乙醇為溶劑，提取溫度30 ℃，料液比1∶10 g/ml的條件下，選擇20、40、60、80 min的時(shí)間進(jìn)行提取，分析提取時(shí)間對(duì)大蒜渣多酚物質(zhì)提取效果的影響。

1.2.2.4提取溫度對(duì)多酚提取的影響。固定料液比1∶10 g/ml、提取時(shí)間60 min、乙醇濃度60%條件下，分別選擇20、30、40、50、60 ℃對(duì)大蒜渣中多酚進(jìn)行提取，分析提取溫度對(duì)大蒜渣多酚物質(zhì)提取效果的影響。

1.2.2.5料液比對(duì)多酚提取的影響。在提取溫度為30 ℃和提取時(shí)間為60 min、乙醇濃度為60%的條件下，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/ml的料液比對(duì)大蒜渣多酚進(jìn)行提取，分析料液比對(duì)大蒜渣多酚物質(zhì)提取效果的影響。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的范圍，將乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比作為考察因素，以總多酚含量為指標(biāo)，用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。

1.2.4多酚含量的測定。以焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用酒石酸亞鐵分光光度法測定總酚含量，總酚含量以沒食子酸當(dāng)量表示[7]。

顯示劑的配制：稱準(zhǔn)確量0.25 g硫酸亞鐵，1.25 g酒石酸鉀鈉，加蒸餾水溶解，定容至250 ml。緩沖溶液的配制：將等濃度的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按一定體積比混合均勻，得pH為7.40的磷酸鹽緩沖溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20 mg沒食子酸，用60%丙酮-水溶液溶解，并在100 ml容量瓶中定容，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml的儲(chǔ)備液。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別準(zhǔn)確移取0.2 mg/ml焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于6支試管中，依次加入60%丙酮水溶液至試管總體積均為1.0 ml，然后再依次向其中加入1.0 ml顯色劑，用緩沖溶液定容，搖勻，放置20 min，于波長540 nm處測定吸光度，以焦性沒食子酸含量（μg）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的OD540 nm為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2大蒜渣多酚類物質(zhì)得率的測定。在一定試驗(yàn)條件下對(duì)原料進(jìn)行多酚物質(zhì)提取，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得多酚粗提液。按“1.2.4.1”方法測定提取液吸光度，計(jì)算大蒜渣中多酚類物質(zhì)的得率（μg/g）。

1.2.4.3多酚含量計(jì)算。公式如下：

式中，W為多酚提取含量（μg/g）；C為酒石酸亞鐵分光光度法測定的提取液多酚質(zhì)量（μg）；n為酒石酸亞鐵分光光度法測定時(shí)提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積（ml）；m為提取時(shí)大蒜渣質(zhì)量（g）。

1.2.5多酚還原能力的測定[8]。pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 ml中分別加入不同濃度的試樣液2.5 ml、1%鐵氰化鉀溶液2.5 ml，混合均勻，50 ℃恒溫20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml，3 000 r/min離心10 min。取上層清液2.5 ml加蒸餾水2.5 ml和0.1%FeCl3溶液0.5 ml，于波長700 nm處測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇多酚類物質(zhì)具有較大極性，易溶于極性溶劑。試驗(yàn)采用乙醇、甲醇2種常規(guī)有機(jī)溶劑和蒸餾水研究大蒜渣多酚提取的效果（圖1）。圖1表明，3種不同溶劑的提取效果存在一定差異，其中以60%乙醇的提取效果最好，60%甲醇的提取效果次之，而蒸餾水的提取效果最差。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用乙醇、水混合體系作為提取溶劑。

2.2乙醇濃度對(duì)多酚提取效果的影響試驗(yàn)得出，在乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時(shí)，大蒜渣多酚提取含量依次為29.50、26.89、40.80、166.8、199.9 μg/g。

由試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度在20%～60%時(shí)，大蒜渣多酚的提取含量隨著乙醇濃度的上升呈一定的增加趨勢，原因可能是多酚在乙醇水溶液中的溶解度逐漸增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%以上時(shí)，由于提取液中除多酚外的其他雜質(zhì)逐漸增多及提取溶劑中水分減少引起的通透性變差等原因，造成多酚含量測定體系中具有一定的渾濁或絮狀沉淀，測定數(shù)據(jù)躍升，無法以酒石酸亞鐵分光光度法來準(zhǔn)確測量其中的多酚含量。

2.3提取時(shí)間對(duì)大蒜渣多酚提取效果的影響圖2表明，大蒜渣中多酚的提取量隨提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在60 min時(shí)達(dá)到峰值，60 min后隨著時(shí)間的增加多酚提取量出現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，大蒜渣中多酚物質(zhì)的溶解程度逐漸增強(qiáng)，而在60 min時(shí)達(dá)到峰值后，多酚的溶出已經(jīng)接近于飽和，再繼續(xù)增加提取時(shí)間的時(shí)候，析出的多酚由于受光、熱、多酚氧化酶等各種外界因素的影響，極易被氧化。因此，60 min后反而隨著時(shí)間的增加多酚提取量出現(xiàn)下降的情況。

2.4料液比對(duì)多酚提取量的影響圖3表明，隨著料液比中溶劑的逐步增加，大蒜渣中多酚提取量也逐漸增加。這可能是因?yàn)殡S著料液比中溶劑的增加，大蒜渣多酚在提取液中的溶解度逐漸增大。

2.5提取溫度對(duì)多酚提取量的影響圖4表明，隨著提取溫度的升高，多酚提取量增加，當(dāng)提取溫度為40 ℃時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，再增加提取溫度，多酚提取量逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S著溫度的上升而產(chǎn)生大量的熱能，從而破壞了大蒜渣內(nèi)各物質(zhì)之間的氫健和疏水健，致使大量多酚物質(zhì)擴(kuò)散出來；提取溫度達(dá)到40 ℃以后，再增加提取溫度，大蒜渣多酚提取量的下降可能與多酚的熱穩(wěn)定性或者多酚氧化酶催化作用的加強(qiáng)有關(guān)。

2.6大蒜渣多酚提取工藝條件的優(yōu)化根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)L9（34），對(duì)影響大蒜渣多酚提取率的4個(gè)主要影響因素乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度進(jìn)行研究，以便進(jìn)一步優(yōu)化多酚提取條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知，影響大蒜渣中多酚物質(zhì)提取量4因素主次順序?yàn)椋篊>B>A>D，即提取時(shí)間>溫度>乙醇濃度>料液比，表明提取時(shí)間對(duì)大蒜渣多酚提取影響最大，其次為提取溫度和乙醇濃度，料液比影響較小。從大蒜渣中提取多酚的最佳條件為A3B3C3D3，即提取溫度為50 ℃、乙醇濃度65%、料液比1∶20 g/ml、提取時(shí)間70 min。

2.7多酚還原能力的測定抗氧化劑是一類能夠抑制有害物質(zhì)并使生物組織的生理氧化過程趨于正常的物質(zhì)。作用機(jī)制主要是通過本身的還原作用給出電子以中和自由基，在此過程中，抗氧化劑自身將被氧化，其還原能力越強(qiáng)則抗氧化活性越強(qiáng)。因此，可通過測定物質(zhì)還原能力來表明其抗氧化活性的強(qiáng)弱。測定還原能力的大小是以被測樣品的電子供應(yīng)是否良好為指標(biāo)的，供應(yīng)的電子不僅可以使Fe3+被還原成Fe2+外，還能同自由基發(fā)生反應(yīng)，使得自由基轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的惰性類物質(zhì)，從而中斷自氧化連鎖反應(yīng)。同時(shí)，還原能力還可能與樣品的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，分子的未共用電子對(duì)越多，它的還原能力就越強(qiáng)。由圖5可知，在試驗(yàn)檢測的濃度范圍內(nèi)，大蒜渣多酚粗提液是很好的電子供應(yīng)者，擁有良好的還原能力，且隨著多酚濃度越高，其還原能力變得越強(qiáng)。

3結(jié)論與討論

作為一類多羥基化合物，多酚易溶或可溶于水、醚、醇、酮、酯類等，因此，因工藝簡便、成本低廉、純度高等優(yōu)點(diǎn)，溶劑萃取法成為目前國內(nèi)使用最普遍的多酚提取方法之一。在溶劑萃取法提取多酚的過程中，溶劑起到的作用就是最大限度地去削弱生物分子之間作用力，以便盡可能地增強(qiáng)目標(biāo)分子與溶劑分子之間相互作用力[9-10]。因此，試驗(yàn)中乙醇、甲醇、蒸餾水對(duì)大蒜渣多酚提取的效果差異可能與3種提取劑的極性大小有關(guān)，也可能跟大蒜渣的細(xì)胞膜通透性有關(guān)，或者可能與植物組織中蛋白質(zhì)、生物堿等物質(zhì)鍵之間的相互締合方式有關(guān)。

多酚作為極性有機(jī)溶劑，既有親水基團(tuán)又有疏水基團(tuán)，從廣義上說，也是一種表面活性劑[9]。在生化物質(zhì)的萃取過程中，受到提取劑濃度、溶液pH、提取時(shí)間、提取液體積、溫度等各種外界條件所影響。通過對(duì)乙醇法提取大蒜渣多酚物質(zhì)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，提取時(shí)間對(duì)大蒜渣多酚的提取影響最大，其次是提取溫度和乙醇濃度，料液比影響最小。該試驗(yàn)通過優(yōu)化得出了從大蒜渣中提取多酚的最佳條件：提取溫度為50 ℃、乙醇濃度65%、料液比1∶20 g/ml、提取時(shí)間70 min。

多酚通過還原反應(yīng)能夠降低環(huán)境中氧含量，同時(shí)作為氫供體，提供質(zhì)子，進(jìn)而與環(huán)境中自由基結(jié)合，清除自由基，且對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著提取液多酚濃度的增加其還原能力也會(huì)相應(yīng)增加，表明大蒜渣多酚物質(zhì)是電子供應(yīng)者，具有良好的還原能力，是一種天然的抗氧化劑。

該試驗(yàn)的原料是大蒜蒸餾提取精油后的固體廢渣，其多酚含量雖已大大受損減少，但通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)仍能提取出較高含量的多酚，這為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)大蒜渣中多酚等有效成分的綜合利用，提高大蒜資源的附加值提供了理論和試驗(yàn)參考。

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