肉毒毒素重組抗原表達系統(tǒng)研究進展

摘要 肉毒中毒是肉毒桿菌引起的一種致死性的神經麻痹性疾病，應對肉毒中毒的最有效方法是預防或疫苗接種，肉毒毒素Hc段是研制亞單位疫苗的首選。通過基因重組技術能夠將肉毒毒素Hc片段在大腸桿菌或酵母表達系統(tǒng)中進行大規(guī)模表達。闡述了這2種表達載體在肉毒毒素亞單位疫苗的研制及發(fā)酵生產情況。

關鍵詞 肉毒梭菌；肉毒神經毒素；畢赤酵母；高密度培養(yǎng)

中圖分類號S855.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10567-02

基金項目山東省引進外國專家項目（370020120077）；濱州市科技發(fā)展計劃項目（2011GG103）。

作者簡介付強（1980- ），男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，從事疫苗發(fā)酵生產研究。*通訊作者，研究員，從事畜牧研究與開發(fā)。

肉毒中毒是由肉毒毒素（BoNTs）引起的一種致死性的神經麻痹性疾病。肉毒毒素是革蘭氏陽性的肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧環(huán)境下產生的一種外毒素。它是人類目前已知的毒素中毒力最強的毒素[1]，其毒性是氰化鉀的10 000倍，對人的最小致死量約為0.1 μg。根據(jù)毒素抗原性不同，肉毒桿菌分為7型：A、B、C、D、E、F、G型，其中引起人類疾病的是A、B、E和F型，以A型肉毒桿菌產生的毒素毒性最強；C型和D型毒素主要引起畜禽和野鳥中毒。

各血清型BoNT的結構基本相同，均是由輕鏈（LC）和重鏈（HC）2個亞單位靠二硫鍵相連組成的雙鏈結構，Hc為產生最佳免疫保護效果的最小毒素片段，是肉毒毒素疫苗研究的靶抗原。傳統(tǒng)類毒素疫苗需要培養(yǎng)大量肉毒梭菌來提取肉毒毒素，再經甲醛（福爾馬林）滅活，制備過程安全性較低。隨著肉毒毒素表位及保護性抗原研究的深入，制備無毒性毒素保護性抗原片段（即重組毒素rHc片段）作為候選疫苗，會使疫苗安全性大大提高[2]。通過基因重組技術，能夠將rHc片段在大腸桿菌或酵母表達系統(tǒng)中進行大規(guī)模表達，制備的疫苗免疫攻毒試驗可獲得良好效果。

1大腸桿菌表達肉毒毒素抗原

大腸桿菌表達系統(tǒng)可有效表達異源蛋白，具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉化效率高的優(yōu)點，多種活性蛋白通過此系統(tǒng)表達獲得，被廣泛應用于醫(yī)療領域[3]。大腸桿菌表達外源蛋白有2種類型，可溶性和非可溶性（包涵體），大多數(shù)研究人員更傾向于可溶性蛋白的表達，但存在易降解的缺點。

絕大多數(shù)肉毒重組抗原在大腸桿菌表達使用pET質粒。這些質粒攜帶T7啟動子和pBR322復制原點，蛋白表達能力強但可通過降低誘導物的濃度來削弱蛋白表達，以提高某些目的蛋白的可溶部分產量。也使用T5啟動子降低表達水平，從而增加了表達蛋白的可溶性，但此表達并非完全有效[4-5]。另外一種方法是使用融合標簽，研究表明某些高度可溶的蛋白質在與其他易形成包涵體的蛋白質融合后會促進融合蛋白質以可溶形式表達。例如，谷胱甘肽S-轉移酶（GST）[6]、硫氧還蛋白（TRX）[7] 和麥芽糖結合蛋白（MBP）[8]已被成功表達可溶性肉毒抗原，這些融合標簽將為進一步的蛋白濃縮、提純、檢測等提供便利，同時也可以有效抑制宿主蛋白酶的降解活性。

在規(guī)模化生產中，需要通過工藝優(yōu)化來降低生產成本，傳統(tǒng)的LB肉湯、2YT和TB成分復雜不適合工業(yè)化生產。此外，肉湯培養(yǎng)基含有動物源蛋白成分，增加了朊病毒的風險。選用M9培養(yǎng)基可用于肉毒抗原的生產[9-10]。培養(yǎng)基中的誘導劑控制啟動子誘導蛋白表達，最常用的誘導劑為IPTG，使用濃度范圍約0.05～1.00 mmol/L，優(yōu)化濃度僅在很少情況下確定，關鍵在于誘導時間。搖瓶培養(yǎng)初始誘導濃度（OD600）為0.5～0.8，極少數(shù)使用高的濃度。然而，在高密度培養(yǎng)條件下，誘導時OD600在分批發(fā)酵為10～20，補料培養(yǎng)可達到90左右[10]。此外，在工程菌中需要添加抗生素，以維持菌體質粒的穩(wěn)定，其添加量會對外源蛋白表達產生影響。

溫度會影響菌體的代謝活性，進而影響蛋白表達。在蛋白表達的發(fā)酵培養(yǎng)中，一般分為2個階段，菌體增殖階段一般為大腸桿菌的最適溫度37 ℃，極少數(shù)報道為30 ℃[11]，而在誘導表達階段溫度選取各研究報道差異較大，但大體可分為為3種類型：低溫（16～18 ℃）、中溫（25～30 ℃）、正常溫度（37 ℃）[10-12]，隨著培養(yǎng)方式的不同，蛋白誘導時間也有差異，從3 h到30 h不等。

發(fā)酵培養(yǎng)結束后，菌體細胞需要處理以獲得純化的重組蛋白。當前多使用帶多聚組氨酸標簽（6×His-tag）的重組肉毒蛋白可以與Ni2+NAT樹脂中的Ni2+螯合而得到快速純化。另外，離子交換、凝膠過濾等可結合親和色譜法進一步純化。在揺瓶誘導過程可獲得1～220 mg/L的表達蛋白，優(yōu)化各發(fā)酵條件的高密度培養(yǎng)（HCDC）工藝可極大提高rBoNT產量，一般分批發(fā)酵培養(yǎng)產量為60 mg/L，但采用補料培養(yǎng)HCDC工藝，雖然表達時間僅有3 h，但rBoNT表達量達到468 mg/L[10]。

2畢赤酵母表達肉毒毒素抗原

最早建立的用于外源蛋白生產的真核表達系統(tǒng)是釀酒酵母表達系統(tǒng)，其在食品工業(yè)中的應用已有數(shù)千年的歷史，但釀酒酵母不適合高密度培養(yǎng)，外源基因表達水平較低。并不是表達外源基因的理想宿主菌，Ogata等1969年首次發(fā)現(xiàn)1種嗜甲醇酵母——巴斯德畢赤酵母，其強有力醇氧化酶（AOX1）基因啟動子，嚴格調控外源蛋白的表達。在甲醇為唯一碳源的條件下生長，可產生近30%的蛋白含量。隨著基因工程技術的發(fā)展，已從最初用于畢赤酵母表達的野生型菌株NRRLY11430改造衍生出多種用于外源蛋白表達的畢赤酵母菌株，如組氨酸缺陷型菌株GS115、KM71和MC1003。

因為甲醇具有毒性、易燃，在食品和醫(yī)療領域中的使用受到限制，現(xiàn)已改造出多種不需要甲醇為唯一誘導劑的啟動子，如GAP啟動子和GCW14啟動子[13]等，其表達量接近AOX1啟動子。近年來，有學者應用雙啟動子策略可提高蛋白在畢赤酵母中的表達量。李紅亮等[14]應用AOX1和GAP雙啟動子共表達體系，人胰島素原在畢赤酵母中的表達量最高可達到單啟動子表達量的5倍，但這些技術在肉毒蛋白表達方面還未見報道。

天然BONT的Hc片段基因中富含A-T堿基和稀有密碼子，通過降低A-T含量及同義密碼子置換人工合成Hc段基因（rHc），以提高酵母菌表達量，是研究者采取共同的方法，外源DNA轉入畢赤酵母后，通過抗生素、營養(yǎng)缺陷載體選擇陽性重組酵母。例如，使用pHILD4 表達載體，其包含HIS4的編碼序列以彌補GS115的缺失基因。另有研究者使用來自pPICZ 家族（Invitrogen）的質粒，依靠博來霉素（Zeocin）抗性來選擇[15-16]。

酵母可以表達外分泌型蛋白（如采用pPIC9K載體），但經過糖基化修飾過程，改變了重組毒素蛋白rBoNT的免疫原性，造成免疫失敗，有些研究者采用胞內表達可溶性rBoNT方式 [15-16]，但存在大批量破碎酵母細胞壁的問題。此外，與大腸桿菌相比，畢赤酵母的誘導表達時間較長（9～74 h）[16]。

與大腸桿菌表達系統(tǒng)的誘導劑IPTG相比，甲醛成本較低，在培養(yǎng)過程甲醇濃度一般0.2%～1.1%，一般通過甲醇生物傳感器進行甲醇濃度控制，但存在響應延遲和不穩(wěn)定的問題，也可根據(jù)溶氧變化來間接判斷甲醇（碳源）的利用情況。

關于畢赤酵母發(fā)酵蛋白的產量，據(jù)報道實驗室表達水平為2.5 g rBoNT/kgWCW（濕重），中試產量為1.6 g rBoNT/kg WCW[16]和3 g rBoNT/kgWCW[17]。由于不同研究者采取的提取工藝及純化方法存在差異，其產量不能直接比較，僅作參考。

3展望

上述表達系統(tǒng)生產的亞單位疫苗，經過免疫學檢測可獲得比較滿意的效果，研究表明添加佐劑如AL（OH）3、LTB[18]、GPA[19]等或表達融合蛋白[15]均可以明顯提高亞單位疫苗的效果，但還存在以下問題：①試驗對象多以小鼠為模型動物，少數(shù)為馬、牛等大型牲畜，臨床試驗有待繼續(xù)研究。②大腸桿菌表達系統(tǒng)易產生內毒素和包涵體，畢赤酵母表達的蛋白糖基化修飾過度、細胞壁裂解等問題并未徹底解決。③肉毒毒素有7個血清型，不存在交叉保護，如何研制多價疫苗。除上述2種表達系統(tǒng)外，還有其他表達方法用于試驗性研究，如桿狀病毒表達系統(tǒng)[20]、塞姆利基森林病毒復制子（SFV）載體系統(tǒng)[21]、無細胞表達系統(tǒng)[22]。雖然已經取得一定成果，但此表達系統(tǒng)成本較高，目前還不太適合工業(yè)化生產需要。相信隨著科學水平的進步及各專業(yè)技術人員的共同努力，重組蛋白的表達及生產技術將取得更大進步。

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