葡萄抗寒砧木外植體愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系的研究

摘要 [目的] 研究葡萄抗寒砧木外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生體系的建立。 [方法]以河岸、山河系列葡萄抗寒砧木為試材，采用對比試驗和正交試驗，研究葡萄試管苗再生的最佳外植體、最佳激素組合。[結(jié)果] 通過對葡萄葉片、葉柄砧、無芽莖段、新根再生的研究，得出最佳再生外植體為葉柄砧。利用細(xì)胞分裂素6BA、TDZ與生長素組合誘導(dǎo)不定芽，MS+6BA 3.0mg/L+NAA 0.05 mg/L不定芽生成誘導(dǎo)率為6.52%；以MS+TDZ 3.0 mg/L+IAA 0.05 mg/L為培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為2.5%。[結(jié)論] 建立了葡萄抗寒砧木的再生體系。

關(guān)鍵詞 葡萄； 愈傷組織； 不定芽； 再生體系

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10464-03

作者簡介趙榆（1982- ），女，遼寧沈陽人，工程師，碩士，從事環(huán)境毒理方面的研究。

葡萄（Vitis vinifera L.）是葡萄科（Vitaleae）葡萄屬（Vitis）多年生落葉漿果類果樹。葡萄抗寒砧木河岸系列、山河系列擁有其獨特的抗蟲、抗病、抗逆性，特別是抗寒特性，是抗病抗逆育種的重要種質(zhì)資源，日益受到國內(nèi)育種專家的重視。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段對葡萄進行遺傳轉(zhuǎn)化，可以有目的地改善不利性狀或敲入抗性基因來提高自身優(yōu)良性狀。葡萄再生轉(zhuǎn)化體系的建立不僅為抗病基因、無核基因的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)，而且為干擾素基因、胰島素基因和各類抗體基因的轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)藥物蛋白、保健食品和植物疫苗等研究提供技術(shù)保證[1]。葡萄再生較困難[2-3]，僅有少數(shù)葡萄品種獲得轉(zhuǎn)基因植物，器官發(fā)生途徑易產(chǎn)生嵌合體，胚狀體誘導(dǎo)不僅過程復(fù)雜，時間要求長，誘導(dǎo)效果也不佳，且受到基因型的限制，僅有少數(shù)品種產(chǎn)生體細(xì)胞胚。因此建立高效的再生體系，才有可能促進葡萄分子育種的發(fā)展。

1材料與方法

1.1試驗材料試材選用河岸品系1～3號，山河品系2～4號，取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園，取冬季休眠枝，室內(nèi)水培，待新梢萌發(fā)8～10 cm剪下，剪成單芽或雙芽莖段，放入已滅菌的三角瓶中，用75%乙醇消毒10 s，無菌水沖洗3次，用0.1%升汞（HgCl2）溶液進行表面消毒5～8 min，無菌蒸餾水徹底沖洗莖段殘留升汞，用無菌濾紙吸干水分，接入初代培養(yǎng)基中，建立無菌培養(yǎng)體系。

1.2培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)條件基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖3%，瓊脂6 g/L，添加不同濃度的激素。滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.8，然后分裝到100 ml三角瓶中，在121 ℃下滅菌20 min。

培養(yǎng)室光強2 000～2 500 lx，光照14 h/d，溫度（24±2）℃。

1.3不同外植體愈傷組織的形成從無菌培養(yǎng)體系中選取大小適中、顏色正常的葉片（0.5 cm×1.0 cm）、葉柄砧（葉片留約0.5 cm長的葉柄）、無芽莖段、新根，平放于培養(yǎng)基表面，經(jīng)15 d暗培養(yǎng)后取出，把三角瓶放入培養(yǎng)室中，45 d后觀察愈傷組織的生成情況。

1.4暗培養(yǎng)時間對愈傷組織生成的影響從培養(yǎng)體系中選取幼嫩葉片，剪成0.5 cm×1.0 cm大小，接入培養(yǎng)基表面，放入人工氣候箱進行暗培養(yǎng)5、15、25 d，培養(yǎng)箱溫度（24±2）℃，取出后置入散射光（光強2 000～2 500 lx）中培養(yǎng)，45 d后調(diào)查愈傷組織形成類型和生成量。

1.5瓶內(nèi)瓶外葉片對再生效果的影響取室內(nèi)水培新梢頂部的幼嫩葉片經(jīng)上述消毒過程消毒，吸干后接入培養(yǎng)基中；取無菌培養(yǎng)體系中無菌苗的幼嫩葉片為外植體，接入相同培養(yǎng)基中。

以上試驗培養(yǎng)基為MS+6BA 5.0 mg/L+0.01 mg/L。

1.6不同6BA濃度對愈傷組織及不定芽生成的影響取無菌苗葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基，添加細(xì)胞分裂素6BA 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/L，NAA 0.05 mg/L。60 d后調(diào)查愈傷組織的及不定芽的生成。

1.7生長素與不同濃度細(xì)胞分裂素TDZ組合對愈傷組織及不定芽生成的影響以山河2號試管苗為外植體，取幼嫩葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基。生長素IAA濃度為0.05 mg/L，TDZ濃度為10、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L。每瓶接8個外植體，共接5瓶，共40個外植體，重復(fù)3次，60 d后調(diào)查愈傷組織及不定芽的生成。

1.8不同濃度生長素與細(xì)胞分裂素TDZ組合對愈傷組織生成的影響以山河2號為試材，取幼嫩葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基。生長素IAA濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L，TDZ濃度為2.0 mg/L。每處理20個外植體，2次重復(fù)，60 d后調(diào)查愈傷組織及不定根的生成。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)將不同外植體平放于MS+6BA 5.0 mg/L+0.01 mg/L培養(yǎng)基中。接種后進行15～20 d暗培養(yǎng)，不同外植體都有愈傷組織形成，愈傷組織最初均為白色。葉片切口生成愈傷組織比率大，且葉尖易產(chǎn)生愈傷，可能與葉片不同部位不同激素濃度有關(guān)。愈傷組織在光照培養(yǎng)條件下慢慢變?yōu)槿榘咨Y(jié)構(gòu)致密，干燥。葉柄砧極易產(chǎn)生愈傷組織，淺白色，淺綠色，致密，干燥，是生成不定芽的有效愈傷組織。無芽莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織產(chǎn)生于莖段兩端，莖段中間幾乎不生成愈傷。莖段中部顏色一直為接入時的綠色，而兩端愈傷組織先生成淺黃色，隨著在光照下培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織變?yōu)楹稚?。新根作為外植體經(jīng)暗培養(yǎng)后生成褐色愈傷組織，隨著光照培養(yǎng)時間的增加，褐色愈傷組織逐漸裂開，露出白色粉狀愈傷組織，隨后白色變?yōu)楹稚?，死亡?/p>

由表1可知，葉柄砧作為外植體愈傷組織生成率最高為66.55%，其次為無芽莖段50.07%、葉片47.52%和新根3516%，但無芽莖段和新根生成的愈傷組織易變褐，不能繼續(xù)培養(yǎng)。而葉片愈傷組織誘導(dǎo)率雖然不高，為47.52%，但為白色，致密的愈傷組織可以繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成不定芽，因此，葉柄砧及葉片為適合誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

2.2不同暗培養(yǎng)時間對愈傷組織生成的影響由表2可知，暗培養(yǎng)25 d后移至光照下培養(yǎng)，45 d后愈傷組織量適中，顏色綠色，為效果最好的愈傷組織；而暗培養(yǎng)15 d后移至光照下培養(yǎng)，45 d后愈傷組織量很少，只有邊緣產(chǎn)生少量的淺綠色愈傷組織；暗培養(yǎng)35 d的愈傷組織生成量極顯著大于暗培養(yǎng)15 d和25 d，但愈傷組織體積較大且顏色較深，愈傷組織邊緣出現(xiàn)紅色，少數(shù)褐化，不適合產(chǎn)生不定芽。

2.3瓶內(nèi)瓶外葉片對再生效果的影響以瓶內(nèi)無菌葡萄苗葉片和水培新抽生的幼嫩有菌苗葉片為試材，研究瓶內(nèi)瓶外葉片的再生效果。瓶內(nèi)葉片在無菌條件中，因此，不經(jīng)消毒過程，直接接入再生培養(yǎng)基即可，接入后顏色為淺綠色，7 d后，葉片邊緣及葉脈處均膨大變綠產(chǎn)生致密的愈傷組織或產(chǎn)生少量淺黃色疏松的愈傷組織。葉柄砧處愈傷組織膨大率66.83%，大于葉片傷口處的愈傷組織膨大率48.16%；瓶外葉片經(jīng)升汞消毒5 min后，接入培養(yǎng)基，葉片顏色深綠，接入7 d后因受消毒劑的影響葉片邊緣少量褐化，葉脈處也不產(chǎn)生愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，葉片皺縮稍有膨大，但均產(chǎn)生愈傷組織及不定芽（表3）。

2.4不同6BA濃度對愈傷組織及不定芽生成的影響由表4可知，不同6BA濃度對愈傷組織的生成有影響，6BA 1.0 mg/L時葉片不生成愈傷組織；6BA 3.0 mg/L時愈傷組織生成率不斷增大；5.0 mg/L時生成率達到最高，然后隨6BA濃度的增大又有下降。6BA 5.0 mg/L時生成的愈傷組織顏色濃綠，質(zhì)地緊密，少量葉片愈傷組織膨大后連成一片；6BA 3.0 mg/L時外植體愈傷組織量適中，極少數(shù)體積適中的愈傷組織邊緣或切割處形成不定芽，而絕大數(shù)愈傷組織不能分化出不定芽。6BA 3.0和5.0 mg/L時，外植體出芽率分別為8.89%和6.52%，其他濃度6BA未生成不定芽。

2.5生長素與不同濃度細(xì)胞分裂素TDZ組合對愈傷組織及不定芽生成的影響以MS為基本培養(yǎng)基加入不同濃度TDZ，配合IAA 0.05 mg/L，暗培養(yǎng)20 d，調(diào)查愈傷組織的生成情況。由表5可知，TDZ 1.0 mg/L時愈傷組織生成率最高，為17.14%；TDZ濃度為3.0 mg/L時，愈傷組織生成率為1132%，隨著TDZ濃度的增加，愈傷組織生成率呈下降趨勢；TDZ 1.5 mg/L時愈傷組織生成量最高，達到12.65 g，隨著TDZ濃度增加而逐漸降低，至3.0 mg/L時為6.03 g；TDZ濃度在1.0～3.0 mg/L時愈傷組織褐化率由11.43%降至0。愈傷組織類型均為綠色致密結(jié)構(gòu)，生長旺盛，且愈傷組織生成的起點多為葉柄砧處及葉片傷口處，葉片正反放置對愈傷組織的生成無明顯影響。TDZ為3.0 mg/L時，葉柄砧處20 d后有不定芽生成，45 d展一葉，葉片皺縮，誘導(dǎo)率為2.5%。說明TDZ濃度的增大有助于不定芽的生成。

2.6不同濃度生長素與細(xì)胞分裂素TDZ組合對不定根生成的影響以MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的生長素IAA與細(xì)胞分裂素TDZ組合，研究不同生長素濃度對愈傷組織生成的影響。由表6可知，IAA濃度為0時愈傷組織生成率為27.5%，之后隨著IAA濃度的增加變化不大，均在40%～50%，當(dāng)IAA濃度升到0.40 mg/L時，愈傷組織生成率明顯增加，達到77.5%，IAA濃度達到0.50 mg/L時，愈傷組織生成率也達到最高，為80.0%。IAA濃度為0.40時，愈傷組織生成量最高為58.8 g；IAA濃度為0.20 mg/L時，愈傷組織生成量最少為19.9 g，可以看出無生長素的培養(yǎng)基，愈傷組織也可以生成，但當(dāng)加入量為0.4 mg/L以上時，有大幅度的增加，說明TDZ有誘導(dǎo)外植體生成愈傷組織的能力，在誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽生成的培養(yǎng)基中加入生長素大于0.30 mg/L，形成較多的愈傷組織，影響不定芽的分化。誘導(dǎo)愈傷組織生成的過程中，葉片褐化，可能是由于接入外植體本身分泌有害酚類或是培養(yǎng)基中的滲透勢大小的作用及激素濃度的大小多方面因素引起，在此試驗中，IAA濃度為0時褐

3小結(jié)與討論

對葡萄再生和轉(zhuǎn)基因的研究，國內(nèi)仍停留在葡萄再生體系的建立階段，葡萄再生較為困難，尚未找到適合轉(zhuǎn)基因的高效再生體系，目前任務(wù)仍是從多種基因型中選出再生能力強的基因型為試材進行轉(zhuǎn)基因研究。材料的遺傳背景對再生影響很大，同一植物不同品種、不同部分都存在較大差異，品種之間分化頻率和速度也不相同。

該試驗以從國外引進的葡萄抗寒砧木河岸、山河系列為試材，研究其再生體系。結(jié)果表明，河岸、山河系列葡萄外植體再生率均不高，以MS+6BA3.0 mg/L+NAA0.05 mg/L誘導(dǎo)出不定芽，誘導(dǎo)率為8.89%，成苗率為6.52%。應(yīng)用細(xì)胞分裂素TDZ誘導(dǎo)不定芽生成，在TDZ3.0 mg/L+IAA0.05 mg/L時，誘導(dǎo)率為2.5%。REGENEN等[4]研究葡萄的器官再生，得出砧木不定芽生成率明顯高于栽培品種，砧木前7片幼葉均有再生能力，而栽培品種僅有前2片幼葉有再生能力。該試驗中選用葉片、葉柄砧、無芽莖段和新根為外植體，以葉柄砧誘導(dǎo)愈傷生成率最高。在不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)中，葉柄砧的再生率均高于葉片，但誘導(dǎo)效果均不理想。權(quán)冬玲[5]研究紅地球品種的葉柄、莖段產(chǎn)生不定芽，再生率分別為2.3%和2.6%；再生中愈傷組織的生成率較高。崔福君[6]研究赤霞珠、黑比諾離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生，結(jié)果表明，6BA、KT對葉片愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生基本無作用，增加細(xì)胞分裂素濃度和種類并不能提高離體葉片的再生誘導(dǎo)率。但該試驗中，6BA能夠誘導(dǎo)出不定芽，但誘導(dǎo)不定芽生成率低。

參考文獻

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