葡萄抗寒砧木外植體愈傷組織誘導和植株再生體系的研究

摘要 [目的] 研究葡萄抗寒砧木外植體愈傷組織的誘導和植株再生體系的建立。 [方法]以河岸、山河系列葡萄抗寒砧木為試材，采用對比試驗和正交試驗，研究葡萄試管苗再生的最佳外植體、最佳激素組合。[結果] 通過對葡萄葉片、葉柄砧、無芽莖段、新根再生的研究，得出最佳再生外植體為葉柄砧。利用細胞分裂素6BA、TDZ與生長素組合誘導不定芽，MS+6BA 3.0mg/L+NAA 0.05 mg/L不定芽生成誘導率為6.52%；以MS+TDZ 3.0 mg/L+IAA 0.05 mg/L為培養(yǎng)基，誘導率為2.5%。[結論] 建立了葡萄抗寒砧木的再生體系。

關鍵詞 葡萄； 愈傷組織； 不定芽； 再生體系

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10464-03

作者簡介趙榆（1982- ），女，遼寧沈陽人，工程師，碩士，從事環(huán)境毒理方面的研究。

葡萄（Vitis vinifera L.）是葡萄科（Vitaleae）葡萄屬（Vitis）多年生落葉漿果類果樹。葡萄抗寒砧木河岸系列、山河系列擁有其獨特的抗蟲、抗病、抗逆性，特別是抗寒特性，是抗病抗逆育種的重要種質資源，日益受到國內育種專家的重視。利用現(xiàn)代生物技術手段對葡萄進行遺傳轉化，可以有目的地改善不利性狀或敲入抗性基因來提高自身優(yōu)良性狀。葡萄再生轉化體系的建立不僅為抗病基因、無核基因的轉基因研究奠定基礎，而且為干擾素基因、胰島素基因和各類抗體基因的轉化，生產藥物蛋白、保健食品和植物疫苗等研究提供技術保證[1]。葡萄再生較困難[2-3]，僅有少數(shù)葡萄品種獲得轉基因植物，器官發(fā)生途徑易產生嵌合體，胚狀體誘導不僅過程復雜，時間要求長，誘導效果也不佳，且受到基因型的限制，僅有少數(shù)品種產生體細胞胚。因此建立高效的再生體系，才有可能促進葡萄分子育種的發(fā)展。

1材料與方法

1.1試驗材料試材選用河岸品系1～3號，山河品系2～4號，取自沈陽農業(yè)大學葡萄園，取冬季休眠枝，室內水培，待新梢萌發(fā)8～10 cm剪下，剪成單芽或雙芽莖段，放入已滅菌的三角瓶中，用75%乙醇消毒10 s，無菌水沖洗3次，用0.1%升汞（HgCl2）溶液進行表面消毒5～8 min，無菌蒸餾水徹底沖洗莖段殘留升汞，用無菌濾紙吸干水分，接入初代培養(yǎng)基中，建立無菌培養(yǎng)體系。

1.2培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)條件基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖3%，瓊脂6 g/L，添加不同濃度的激素。滅菌前將培養(yǎng)基的pH調至5.8，然后分裝到100 ml三角瓶中，在121 ℃下滅菌20 min。

培養(yǎng)室光強2 000～2 500 lx，光照14 h/d，溫度（24±2）℃。

1.3不同外植體愈傷組織的形成從無菌培養(yǎng)體系中選取大小適中、顏色正常的葉片（0.5 cm×1.0 cm）、葉柄砧（葉片留約0.5 cm長的葉柄）、無芽莖段、新根，平放于培養(yǎng)基表面，經15 d暗培養(yǎng)后取出，把三角瓶放入培養(yǎng)室中，45 d后觀察愈傷組織的生成情況。

1.4暗培養(yǎng)時間對愈傷組織生成的影響從培養(yǎng)體系中選取幼嫩葉片，剪成0.5 cm×1.0 cm大小，接入培養(yǎng)基表面，放入人工氣候箱進行暗培養(yǎng)5、15、25 d，培養(yǎng)箱溫度（24±2）℃，取出后置入散射光（光強2 000～2 500 lx）中培養(yǎng)，45 d后調查愈傷組織形成類型和生成量。

1.5瓶內瓶外葉片對再生效果的影響取室內水培新梢頂部的幼嫩葉片經上述消毒過程消毒，吸干后接入培養(yǎng)基中；取無菌培養(yǎng)體系中無菌苗的幼嫩葉片為外植體，接入相同培養(yǎng)基中。

以上試驗培養(yǎng)基為MS+6BA 5.0 mg/L+0.01 mg/L。

1.6不同6BA濃度對愈傷組織及不定芽生成的影響取無菌苗葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素6BA 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/L，NAA 0.05 mg/L。60 d后調查愈傷組織的及不定芽的生成。

1.7生長素與不同濃度細胞分裂素TDZ組合對愈傷組織及不定芽生成的影響以山河2號試管苗為外植體，取幼嫩葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基。生長素IAA濃度為0.05 mg/L，TDZ濃度為10、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L。每瓶接8個外植體，共接5瓶，共40個外植體，重復3次，60 d后調查愈傷組織及不定芽的生成。

1.8不同濃度生長素與細胞分裂素TDZ組合對愈傷組織生成的影響以山河2號為試材，取幼嫩葉片全葉（帶葉柄），葉片橫剪幾次接入培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基。生長素IAA濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L，TDZ濃度為2.0 mg/L。每處理20個外植體，2次重復，60 d后調查愈傷組織及不定根的生成。

2結果與分析

2.1不同外植體愈傷組織的誘導將不同外植體平放于MS+6BA 5.0 mg/L+0.01 mg/L培養(yǎng)基中。接種后進行15～20 d暗培養(yǎng)，不同外植體都有愈傷組織形成，愈傷組織最初均為白色。葉片切口生成愈傷組織比率大，且葉尖易產生愈傷，可能與葉片不同部位不同激素濃度有關。愈傷組織在光照培養(yǎng)條件下慢慢變?yōu)槿榘咨Y構致密，干燥。葉柄砧極易產生愈傷組織，淺白色，淺綠色，致密，干燥，是生成不定芽的有效愈傷組織。無芽莖段誘導出的愈傷組織產生于莖段兩端，莖段中間幾乎不生成愈傷。莖段中部顏色一直為接入時的綠色，而兩端愈傷組織先生成淺黃色，隨著在光照下培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織變?yōu)楹稚Ｐ赂鳛橥庵搀w經暗培養(yǎng)后生成褐色愈傷組織，隨著光照培養(yǎng)時間的增加，褐色愈傷組織逐漸裂開，露出白色粉狀愈傷組織，隨后白色變?yōu)楹稚劳觥?/p>

由表1可知，葉柄砧作為外植體愈傷組織生成率最高為66.55%，其次為無芽莖段50.07%、葉片47.52%和新根3516%，但無芽莖段和新根生成的愈傷組織易變褐，不能繼續(xù)培養(yǎng)。而葉片愈傷組織誘導率雖然不高，為47.52%，但為白色，致密的愈傷組織可以繼續(xù)培養(yǎng)，誘導生成不定芽，因此，葉柄砧及葉片為適合誘導愈傷組織的外植體。

2.2不同暗培養(yǎng)時間對愈傷組織生成的影響由表2可知，暗培養(yǎng)25 d后移至光照下培養(yǎng)，45 d后愈傷組織量適中，顏色綠色，為效果最好的愈傷組織；而暗培養(yǎng)15 d后移至光照下培養(yǎng)，45 d后愈傷組織量很少，只有邊緣產生少量的淺綠色愈傷組織；暗培養(yǎng)35 d的愈傷組織生成量極顯著大于暗培養(yǎng)15 d和25 d，但愈傷組織體積較大且顏色較深，愈傷組織邊緣出現(xiàn)紅色，少數(shù)褐化，不適合產生不定芽。

2.3瓶內瓶外葉片對再生效果的影響以瓶內無菌葡萄苗葉片和水培新抽生的幼嫩有菌苗葉片為試材，研究瓶內瓶外葉片的再生效果。瓶內葉片在無菌條件中，因此，不經消毒過程，直接接入再生培養(yǎng)基即可，接入后顏色為淺綠色，7 d后，葉片邊緣及葉脈處均膨大變綠產生致密的愈傷組織或產生少量淺黃色疏松的愈傷組織。葉柄砧處愈傷組織膨大率66.83%，大于葉片傷口處的愈傷組織膨大率48.16%；瓶外葉片經升汞消毒5 min后，接入培養(yǎng)基，葉片顏色深綠，接入7 d后因受消毒劑的影響葉片邊緣少量褐化，葉脈處也不產生愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，葉片皺縮稍有膨大，但均產生愈傷組織及不定芽（表3）。

2.4不同6BA濃度對愈傷組織及不定芽生成的影響由表4可知，不同6BA濃度對愈傷組織的生成有影響，6BA 1.0 mg/L時葉片不生成愈傷組織；6BA 3.0 mg/L時愈傷組織生成率不斷增大；5.0 mg/L時生成率達到最高，然后隨6BA濃度的增大又有下降。6BA 5.0 mg/L時生成的愈傷組織顏色濃綠，質地緊密，少量葉片愈傷組織膨大后連成一片；6BA 3.0 mg/L時外植體愈傷組織量適中，極少數(shù)體積適中的愈傷組織邊緣或切割處形成不定芽，而絕大數(shù)愈傷組織不能分化出不定芽。6BA 3.0和5.0 mg/L時，外植體出芽率分別為8.89%和6.52%，其他濃度6BA未生成不定芽。

2.5生長素與不同濃度細胞分裂素TDZ組合對愈傷組織及不定芽生成的影響以MS為基本培養(yǎng)基加入不同濃度TDZ，配合IAA 0.05 mg/L，暗培養(yǎng)20 d，調查愈傷組織的生成情況。由表5可知，TDZ 1.0 mg/L時愈傷組織生成率最高，為17.14%；TDZ濃度為3.0 mg/L時，愈傷組織生成率為1132%，隨著TDZ濃度的增加，愈傷組織生成率呈下降趨勢；TDZ 1.5 mg/L時愈傷組織生成量最高，達到12.65 g，隨著TDZ濃度增加而逐漸降低，至3.0 mg/L時為6.03 g；TDZ濃度在1.0～3.0 mg/L時愈傷組織褐化率由11.43%降至0。愈傷組織類型均為綠色致密結構，生長旺盛，且愈傷組織生成的起點多為葉柄砧處及葉片傷口處，葉片正反放置對愈傷組織的生成無明顯影響。TDZ為3.0 mg/L時，葉柄砧處20 d后有不定芽生成，45 d展一葉，葉片皺縮，誘導率為2.5%。說明TDZ濃度的增大有助于不定芽的生成。

2.6不同濃度生長素與細胞分裂素TDZ組合對不定根生成的影響以MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的生長素IAA與細胞分裂素TDZ組合，研究不同生長素濃度對愈傷組織生成的影響。由表6可知，IAA濃度為0時愈傷組織生成率為27.5%，之后隨著IAA濃度的增加變化不大，均在40%～50%，當IAA濃度升到0.40 mg/L時，愈傷組織生成率明顯增加，達到77.5%，IAA濃度達到0.50 mg/L時，愈傷組織生成率也達到最高，為80.0%。IAA濃度為0.40時，愈傷組織生成量最高為58.8 g；IAA濃度為0.20 mg/L時，愈傷組織生成量最少為19.9 g，可以看出無生長素的培養(yǎng)基，愈傷組織也可以生成，但當加入量為0.4 mg/L以上時，有大幅度的增加，說明TDZ有誘導外植體生成愈傷組織的能力，在誘導愈傷組織及不定芽生成的培養(yǎng)基中加入生長素大于0.30 mg/L，形成較多的愈傷組織，影響不定芽的分化。誘導愈傷組織生成的過程中，葉片褐化，可能是由于接入外植體本身分泌有害酚類或是培養(yǎng)基中的滲透勢大小的作用及激素濃度的大小多方面因素引起，在此試驗中，IAA濃度為0時褐

3小結與討論

對葡萄再生和轉基因的研究，國內仍停留在葡萄再生體系的建立階段，葡萄再生較為困難，尚未找到適合轉基因的高效再生體系，目前任務仍是從多種基因型中選出再生能力強的基因型為試材進行轉基因研究。材料的遺傳背景對再生影響很大，同一植物不同品種、不同部分都存在較大差異，品種之間分化頻率和速度也不相同。

該試驗以從國外引進的葡萄抗寒砧木河岸、山河系列為試材，研究其再生體系。結果表明，河岸、山河系列葡萄外植體再生率均不高，以MS+6BA3.0 mg/L+NAA0.05 mg/L誘導出不定芽，誘導率為8.89%，成苗率為6.52%。應用細胞分裂素TDZ誘導不定芽生成，在TDZ3.0 mg/L+IAA0.05 mg/L時，誘導率為2.5%。REGENEN等[4]研究葡萄的器官再生，得出砧木不定芽生成率明顯高于栽培品種，砧木前7片幼葉均有再生能力，而栽培品種僅有前2片幼葉有再生能力。該試驗中選用葉片、葉柄砧、無芽莖段和新根為外植體，以葉柄砧誘導愈傷生成率最高。在不同培養(yǎng)基的誘導中，葉柄砧的再生率均高于葉片，但誘導效果均不理想。權冬玲[5]研究紅地球品種的葉柄、莖段產生不定芽，再生率分別為2.3%和2.6%；再生中愈傷組織的生成率較高。崔福君[6]研究赤霞珠、黑比諾離體葉片愈傷組織誘導和不定芽再生，結果表明，6BA、KT對葉片愈傷組織誘導和不定芽再生基本無作用，增加細胞分裂素濃度和種類并不能提高離體葉片的再生誘導率。但該試驗中，6BA能夠誘導出不定芽，但誘導不定芽生成率低。

參考文獻

[1] 周鵬，王躍進，賀普超.人胰島素樣生長因子——Ⅰ基因轉化葡萄的研究[J].熱帶作物學報，2002，23（1）：54-61.

[2] 李金鳳，章鎮(zhèn)，莊智敏，等.離體條件下葡萄砧木‘5BB’植株再生體系研究[J].西北植物學報，2007，27（7）：1323-1328.

[3] 房玉林，劉東，宋士任.圓葉葡萄‘Alachua’葉柄再生體系的建立[J].西北植物學報，2007，27（9）：1777-1781.

[4] REGNER F，ROMAN H.Regeneration of grapevine by means of organogenesis[J].Mitteilungen Klosterneuburg，1994，44（5）：168-174.

[5] 權冬玲.8個葡萄（Vitistlinn）品種再生體系建立的研究[D].蘭州：甘肅農業(yè)大學，2005.