淡紫擬青霉幾丁質酶提取工藝的優化研究

摘要[目的] 為優化淡紫擬青霉幾丁質酶的提取工藝。[方法] 以硫酸銨溶液為提取劑，先通過單因素試驗，確定硫酸銨濃度、透析溫度、透析時間和透析液酸堿度的最佳水平，然后通過正交試驗確定最佳浸提條件。[結果]淡紫擬青霉幾丁質酶的最佳提取工藝為：硫酸銨濃度60%、透析溫度30 ℃、透析時間2 d，透析液pH 6，在該條件下幾丁質酶酶活可達0.053 4 U。[結論] 該結果可以為幾丁質酶的進一步開發和工業化生產提供一定科學依據。

關鍵詞 淡紫擬青霉；幾丁質酶；提取工藝

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10456-03

基金項目浙江省大學生科技創新項目（2011R429010）。

作者簡介金亞琳（1993-），女，浙江臨海人，本科生，專業：生物科學。*通訊作者，副教授，碩士，從事生物資源開發利用方面的研究。

幾丁質（Chitin） 大量存在于昆蟲的外骨骼和中腸圍食膜（peritrophicm embrane，PM ） 中， 也是大多數真菌細胞壁的主要成分[ 1]，已成為真菌病害和農林害蟲有效防治的限制因素之一。幾丁質專一性降解酶是幾丁質酶。該酶能通過水解幾丁質，消解寄主真菌細胞壁，殺死寄主真菌[2-3]，降解昆蟲體壁[4]，擾亂昆蟲和真菌的正常代謝，達到抑制病蟲害的目的。近年來，鑒于幾丁質酶在防治病蟲害方面的巨大利用潛力， 其研究越來越受到重視。

幾丁質酶分布廣泛，從微生物到動植物體內都有幾丁質酶的存在，尤以微生物種類最多。微生物可用于發酵生產，因此對微生物幾丁質酶的研究與開發極具有前景。淡紫擬青霉[Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson]屬半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬[5]。該菌廣泛分布于世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養等優點，能產生豐富的幾丁質酶。近年來對淡紫擬青霉產幾丁質酶發酵條件及其酶學特性進行了大量的研究[6-11]，而對于其提取工藝研究較少。因此，筆者以淡紫擬青霉為材料，先通過液體發酵獲得發酵液，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗確定影響幾丁質酶提取的因素及最適提取條件，為幾丁質酶的進一步開發和工業化生產提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 菌種。 供試菌種為淡紫擬青霉FZ0289，由中國微生物菌種網提供。

1.1.2 培養基。 種子培養基組成為：幾丁質0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，MgSO4 0.05%，氯化鈉0.5%，K2HPO4 0.03%，pH自然。

產酶培養基組成為：1.5%麥芽浸汁為碳源，2%蛋白胨為氮源，3% 100目幾丁質粉，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，pH 6。

1.2透析袋使用前的處理[12] 把透析袋剪成適當長度（10～20 cm）的小段，在大體積的2%（W/V）碳酸氫鈉和 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中將透析袋煮沸10 min，用蒸餾水徹底清洗后放在 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中再煮沸10 min，冷卻后存放于4 ℃，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內。從此時起，取用透析袋時必須戴手套。 用前在透析袋內裝滿水，然后排出，將之清洗干凈。

1.3幾丁質酶活性的測定 采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法[13]，測定還原糖含量，其標準曲線的回歸方程為y=0.840 5x+0.009 9，式中x為N-乙酰葡萄糖質量（mg），y為吸光值，R2=0.996 2。

在3根1.5 ml離心管中分別加入0.5 ml待測液和0.5 ml濃度1%膠體幾丁質；向其中1根離心管加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min，作為對照；另外3根離心管于40 ℃水浴60 min后，加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min。 3根管中均加入5 ml蒸餾水，4 000 r/min離心10 min后，取上清液，于540 nm測量OD，根據N乙酰氨基葡萄糖的標準曲線計算出還原糖含量。酶活力單位（U/ml）表示在上述反應條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖所需酶量。

1.4幾丁質酶的發酵 將活化好的菌種接種到種子培養液中，每瓶100 ml，于28 ℃、180 r/min搖床培養3～4 d后，按10%接種量接種到160 ml/500 ml的產酶培養基中，于28 ℃、180 r/min搖床培養4 d。

1.5幾丁質酶提取工藝的單因素試驗

1.5.1硫酸銨溶液濃度的選擇。 將發酵液經 6 000 r/min離心15 min，各取50 ml上清液依次加入質量分數為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸銨溶液，充分攪拌后靜置5 min，離心取沉淀，然后用 pH 6磷酸緩沖液溶解后透析2 d，在540 nm波長下測定幾丁質酶活性。

1.5.2透析溫度的選擇。 將發酵液經6 000 r/min離心15 min，去除沉淀，取上清液，加濃度60%硫酸銨溶液，充分攪拌后靜置5 min，離心取沉淀，用磷酸緩沖液溶解后分別于25、30、35、40、45 ℃下透析2 d，在540 nm波長下測定幾丁質酶活性。

1.5.3 透析液pH的選擇。 將發酵液經6 000 r/min離心15 min，去除沉淀，取上清液，加濃度60%硫酸銨溶液，充分攪拌后靜置5 min，離心，取沉淀，用磷酸緩沖液溶解后于不同pH透析液中透析，測定酶活。透析液的pH分別為3、4、5、6、7、8。

1.5.4 透析時間的選擇。 將發酵液經6 000 r/min離心15 min，去除沉淀，取上清液，加濃度60%硫酸銨溶液，充分攪拌后，靜置5 min，離心，取沉淀，將其溶解后進行不同時間的透析，設置7個相同的透析試驗組，以7 d為期限，每天取一組透析后酶溶液測定酶活。

1.6幾丁質酶提取工藝條件的正交試驗優化 在單因素研究的基礎上，以硫酸銨溶液濃度、透析時間、透析溫度、透析pH為考察因素，以幾丁質酶活性為指標，設置四因素三水平的正交試驗，優化幾丁質酶提取工藝的最佳參數。

2 結果與分析

2.1幾丁質酶提取工藝的單因素試驗

2.1.1 最佳硫酸銨濃度的確定。在透析溫度30 ℃，透析時間2 d，透析液pH 7的條件下，研究硫酸銨濃度對幾丁質酶提取率的影響。由圖1可知，在20%～60%硫酸銨濃度范圍，幾丁質酶活性逐漸增大，在60%濃度下酶活最大，達到0.024 U/ml。隨后，硫酸銨溶液濃度繼續增加，幾丁質酶活性下降。由此可知，過低的硫酸銨濃度可能讓幾丁質酶不完全沉淀，導致幾丁質酶密度低，催化效率低下。較高濃度下硫酸銨溶液能較好地保持淡紫擬青霉的幾丁質酶活性。但是，過高的硫酸銨濃度可能會破壞幾丁質酶的生物活性，使其喪失應有的催化幾丁質功能。因此，綜合考慮到幾丁質酶提取率和生物學功能的保持，淡紫擬青霉的幾丁質酶最佳硫酸銨溶液浸提濃度為60%。

圖1硫酸銨濃度對幾丁質酶提取率的影響2.1.2 最佳透析溫度的確定。由圖2可知，在25～30 ℃，隨著溫度的升高，幾丁質酶活性不斷增加，在透析溫度為30 ℃時幾丁質酶活性最大，酶活值達0.018 U/ml。當溫度繼續升高后，幾丁質酶活性不斷下降。這可能是由于溫度過高破壞了幾丁質酶的結構，喪失了催化幾丁質的功能，低溫不利于幾丁質酶催化功能的有效發揮[12]。因此，淡紫擬青霉的幾丁質酶的最佳透析溫度為30 ℃。

2.1.3 最佳透析液pH的確定。由圖3可知，在3～6的pH范圍內，幾丁質酶活性隨著pH的上升而增強，在pH為6時，活性最大，酶活達0.022 U/ml。之后，隨著pH的增大，酶活卻不斷下降。pH對酶活性的影響機制很復雜，pH過小（過酸）、過大（過堿）都能使酶蛋白變性而失活[14]。因此，綜合考慮幾丁質酶提取率和生物學功能的保持，淡紫擬青霉的幾丁質酶最佳透析pH為6。

2.1.4 最佳透析時間的確定。由圖4可知，透析前2 d，幾丁質酶活性迅速上升，并在第2天酶活達到最大值（0.019 U/ml）。之后，隨著時間的增加，幾丁質酶活性逐漸下降。由此可知，時間太短，幾丁質酶透析得不充分，自然活性達不到最大值，透析時間過長，硫酸銨溶液和幾丁質酶長時間接觸，可能減小幾丁質酶活性部位的柔性，圖4透析時間對幾丁質酶提取率的影響使得酶的活力降低。因此，幾丁質酶的最佳透析時間為2 d。

2.2幾丁質酶提取條件的正交試驗優化 在單因素研究的基礎上，以硫酸銨溶液濃度（A）、透析時間（B）、透析溫度（C）、透析液pH（D）為考察因素，以幾丁質酶活性為指標，設計四因素三水平的正交試驗，優化幾丁質酶提取工藝的最佳參數，其因素水平見表1，試驗結果見表2。

由表3可知，4個因素的P值均小于0.01，表明透析溫度、硫酸銨濃度、pH、時間對幾丁質酶活性的影響差異在0.01水平顯著，因此在提取幾丁質酶時要控制各因素。由表2的R值可知，4個因素對幾丁質酶浸提的影響順序大小為C>A>D>B，即透析溫度對幾丁質酶提取的影響最大。由K值可知，四因素三水平最佳提取組合為A3B1C2D2，即幾丁質酶

3結論與討論

通過正交試驗，研究了影響淡紫擬青霉幾丁質酶提取的因素。研究表明，淡紫擬青霉幾丁質酶最佳提取工藝條件為硫酸銨濃度60%，透析時間2 d，透析溫度30 ℃，透析pH 6。其中，各因素對幾丁質酶浸提的效果大小順序為透析溫度>硫酸銨濃度> 透析pH >透析時間。溫度過高或過低都會影響酶的活性。溫度低，酶的高效性得不到充分的發揮；溫度高，酶的生物結構易發生變化，甚至完全變異失活。這個過程是不可逆的。作為幾丁質酶的浸提試劑，把酶以沉淀的方式從混合液中浸提出來，濃度的高低會影響沉淀是否徹底。低濃度的硫酸銨溶液易造成不完全沉淀，使單位體積的幾丁質酶量偏少；高濃度的硫酸銨溶液易帶來其他蛋白質雜質。徐春花[15]研究綠粘帚霉菌產幾丁質酶的條件時發現，當用60%～90%飽和度的硫酸銨分離幾丁質酶粗提液時，幾丁質酶活性趨于穩定，其中60%飽和度的硫酸銨效果最好且經濟。該研究正交條件優化試驗得出的最佳硫酸銨飽和度也為60%。

參考文獻

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