HPLC法測(cè)定保健食品中葉酸含量的不確定度評(píng)價(jià)研究

摘要[目的]對(duì)高效液相色譜法測(cè)定保健食品中葉酸含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。[方法]建立了不確定度評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型，對(duì)測(cè)定過(guò)程中各影響因素進(jìn)行分析評(píng)估。[結(jié)果]合成了各變量的不確定度，最終得到測(cè)定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：（33.0±1.7）g/kg（K=2）。[結(jié)論]分析了產(chǎn)生不確定度的主要來(lái)源，為有效地控制用該方法來(lái)測(cè)定葉酸的含量提供可靠的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 不確定度；高效液相色譜法；保健食品；葉酸

中圖分類(lèi)號(hào)S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）30-10651-03

基金項(xiàng)目國(guó)家十二五“重大新藥創(chuàng)制”專(zhuān)項(xiàng)課題——中藥質(zhì)量安全檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)平臺(tái)（2014ZX09304307002）。

作者簡(jiǎn)介石巖（1980- ），男，河南新鄉(xiāng)人，副研究員，碩士，從事中藥及保健食品質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究。

收稿日期20140916葉酸是一種水溶性B族維生素，又名蝶酰谷氨酸、葉片酸，是人體必需維生素之一[1]。葉酸最重要的功能就是制造紅血球和白血球，增強(qiáng)免疫能力，一旦缺乏葉酸，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重貧血，因此葉酸又被稱(chēng)為“造血維生素”。葉酸不僅天然存在于綠葉蔬菜和動(dòng)物肉蛋奶及肝臟中，也可作為一種添加劑被加入到保健食品中，因此準(zhǔn)確測(cè)定保健食品中葉酸含量對(duì)于控制生產(chǎn)加工及產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義[2]。筆者通過(guò)試驗(yàn)，建立了高效液相紫外檢測(cè)法測(cè)定保健食品中葉酸含量的方法[3]，按照J(rèn)JF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[4]、 CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[5]和ISO/IEC 17025-2005《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則》[6]規(guī)定的方法和程序要求，對(duì)該法建立并實(shí)施測(cè)量不確定度的評(píng)估程序，以評(píng)價(jià)測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Waters 2695液相色譜儀（附Waters 2487紫外檢測(cè)器），METTLER 105DU和AE240電子天平，METTLER S40 PH計(jì)。

1.1.2主要試劑。 甲醇、氨水、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀，均為分析純；乙腈為色譜純；葉酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100074200913；供試樣品為成人復(fù)合維生素片，廠(chǎng)家A，批號(hào)：20111204。

1.2方法

1.2.1色譜條件。色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（5 μm，46×250 mm）；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；高效液相色譜流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.3）=10∶90；流速1.0 ml/min。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品10.47 mg，置100 ml量瓶中加0.5%的氨溶液溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液0.2、0.8、1.6、4.0、8.0、10.0 ml分別置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

1.2.3供試品溶液的制備。取10 g以上片劑試樣研碎，混勻，取0.1 g試樣，精確稱(chēng)重，置500 ml棕色量瓶中，加入05%氨水70%甲醇溶液450 ml，搖勻，超聲提取60 min，取出，放冷至室溫，用0.5%氨水70%甲醇溶液定容，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液1 ml，置100 ml棕色量瓶中，加入0.5%氨水70%甲醇溶液，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后供液相色譜分析用。該試驗(yàn)需避光操作。在該試驗(yàn)的色譜條件下，色譜圖見(jiàn)圖1。

1.2.4含量測(cè)定數(shù)學(xué)模型。葉酸含量測(cè)定的數(shù)學(xué)模型如下：

式中，X為供試品中葉酸含量（g/kg）；AX為供試品峰面積；AR為葉酸對(duì)照品峰面積；WR為葉酸對(duì)照品的稱(chēng)取量（mg）；WX為供試品稱(chēng)取量（g）；VX為供試品稀釋體積（ml）；VR為對(duì)照品稀釋體積（ml）；P對(duì)照品純度。

2不確定度來(lái)源的識(shí)別與分析

2.1不確定度來(lái)源根據(jù)含量測(cè)定方法及測(cè)定數(shù)學(xué)模型分析，葉酸含量測(cè)定的不確定度來(lái)源主要包括：①對(duì)照品純度引入的不確定度；②對(duì)照品和樣品的稱(chēng)量引入的不確定度；③對(duì)照品和樣品的定容體積引入的不確定度；④配制對(duì)照品和樣品所用到的玻璃量器引入的不確定度；⑤測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度；⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合等方面引入的不確定度。

2.2不確定度的量化分析

2.2.1對(duì)照品純度的不確定度。葉酸對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度標(biāo)示為90.5%，未提供不確定度值，參考基準(zhǔn)物質(zhì)不確定度值，設(shè)定對(duì)照品含量為90.5%±10%，視為矩形分布，對(duì)照品純度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2天平稱(chēng)重的不確定度。葉酸對(duì)照品稱(chēng)重10.47 mg，檢定證書(shū)中天平稱(chēng)量最大允差為±0.1 mg，稱(chēng)量視為矩形分布（K=3），對(duì)照品天平稱(chēng)重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

供試品稱(chēng)重0.1 g，檢定證書(shū)中天平稱(chēng)量最大允差為±0.001 g，稱(chēng)量視為矩形分布（K=3），供試品天平稱(chēng)重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3溶液稀釋定容及取樣體積的相對(duì)不確定度。

2.2.3.1葉酸對(duì)照品溶液稀釋定容及取樣體積的相對(duì)不確定度。由JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[7]查得A級(jí)100 ml容量瓶的容量允差為±0.10 ml，按矩形分布處理，則葉酸對(duì)照品儲(chǔ)備液定容的不確定度為：

配制各濃度對(duì)照品溶液分別需使用1 ml（取0.2 ml和 0.8 ml），5 ml（取1.6 ml和4.0 ml）和10 ml（取8 ml和10 ml）的分度吸量管及10 ml容量瓶。JJG 196-2006[5]查得A級(jí)1 ml、5 ml和10 ml分度吸量管及10 ml容量瓶的容量允差分別為±0.008 ml、±0.025 ml、±0.05 ml和±0.020 ml，按照矩形分布處理，配制對(duì)照品溶液的相對(duì)不確定度可表示為：

2.2.3.2供試品溶液稀釋定容及取樣體積的相對(duì)不確定度。設(shè)定供試品提取完全，并且濃縮轉(zhuǎn)移也完全，則供試品溶液經(jīng)過(guò)了定容于500 ml量瓶，單標(biāo)線(xiàn)吸量管吸取1 ml，再定容于100 ml量瓶，JJG 196-2006查得A級(jí)500 ml容量瓶、1 ml單標(biāo)線(xiàn)吸量管和100 ml容量瓶的容量允差分別為：±0.25 ml、±0.007 ml和±0.10 ml，均視為矩形分布處理，則上述步驟的相對(duì)不確定度分別為：

2.2.4測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度。取同一供試品溶液，按給定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為1.24%，則高效液相色譜儀的相對(duì)不確定度為：

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度。將配制的濃度分別為1.895、7.580、15.160、37.900、75.800、94750 μg/L的一系列對(duì)照品溶液分別測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)為：Y=a+bX =38 165X+4 985.8，γ=0.999 9。

2.3不確定度的合成把以上各不確定度分量的計(jì)算結(jié)果列成表2，結(jié)果如下：

2.4不確定度的表示由于最后算得該供試樣品中含有葉酸33.0 g/kg，取95%的置信區(qū)間（K=2），則擴(kuò)展不確定度表示為U=2×0.026×3.3=1.7 g/kg。葉酸含量應(yīng)表示為：3討論

用高效液相紫外檢測(cè)法測(cè)定保健食品中葉酸含量的不確定度主要來(lái)源于對(duì)照品定容體積、純度和稱(chēng)量以及供試品的稱(chēng)量引入的不確定度，其次是測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度。因此在實(shí)際檢測(cè)工作中，天平的定期檢定，玻璃量器的校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室溫度的控制以及儀器的定期檢定對(duì)進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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[6] 中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).ISO/IEC17025：2005檢測(cè)與校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則[S].2005.

[7] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006.