HPLC法測定保健食品中葉酸含量的不確定度評價研究

摘要[目的]對高效液相色譜法測定保健食品中葉酸含量的不確定度進行評定。[方法]建立了不確定度評價數(shù)學(xué)模型，對測定過程中各影響因素進行分析評估。[結(jié)果]合成了各變量的不確定度，最終得到測定結(jié)果的擴展不確定度：（33.0±1.7）g/kg（K=2）。[結(jié)論]分析了產(chǎn)生不確定度的主要來源，為有效地控制用該方法來測定葉酸的含量提供可靠的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 不確定度；高效液相色譜法；保健食品；葉酸

中圖分類號S609.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10651-03

基金項目國家十二五“重大新藥創(chuàng)制”專項課題——中藥質(zhì)量安全檢測和風(fēng)險控制技術(shù)平臺（2014ZX09304307002）。

作者簡介石巖（1980- ），男，河南新鄉(xiāng)人，副研究員，碩士，從事中藥及保健食品質(zhì)量控制與評價研究。

收稿日期20140916葉酸是一種水溶性B族維生素，又名蝶酰谷氨酸、葉片酸，是人體必需維生素之一[1]。葉酸最重要的功能就是制造紅血球和白血球，增強免疫能力，一旦缺乏葉酸，會發(fā)生嚴重貧血，因此葉酸又被稱為“造血維生素”。葉酸不僅天然存在于綠葉蔬菜和動物肉蛋奶及肝臟中，也可作為一種添加劑被加入到保健食品中，因此準確測定保健食品中葉酸含量對于控制生產(chǎn)加工及產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義[2]。筆者通過試驗，建立了高效液相紫外檢測法測定保健食品中葉酸含量的方法[3]，按照JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[4]、 CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[5]和ISO/IEC 17025-2005《檢測和校準實驗室認可準則》[6]規(guī)定的方法和程序要求，對該法建立并實施測量不確定度的評估程序，以評價測試結(jié)果的準確性和可靠性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Waters 2695液相色譜儀（附Waters 2487紫外檢測器），METTLER 105DU和AE240電子天平，METTLER S40 PH計。

1.1.2主要試劑。 甲醇、氨水、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀，均為分析純；乙腈為色譜純；葉酸對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：100074200913；供試樣品為成人復(fù)合維生素片，廠家A，批號：20111204。

1.2方法

1.2.1色譜條件。色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（5 μm，46×250 mm）；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm；高效液相色譜流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.3）=10∶90；流速1.0 ml/min。

1.2.2對照品溶液的制備。精密稱取葉酸標準品10.47 mg，置100 ml量瓶中加0.5%的氨溶液溶解并稀釋至刻度，作為儲備液。分別精密量取儲備液0.2、0.8、1.6、4.0、8.0、10.0 ml分別置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

1.2.3供試品溶液的制備。取10 g以上片劑試樣研碎，混勻，取0.1 g試樣，精確稱重，置500 ml棕色量瓶中，加入05%氨水70%甲醇溶液450 ml，搖勻，超聲提取60 min，取出，放冷至室溫，用0.5%氨水70%甲醇溶液定容，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 ml，置100 ml棕色量瓶中，加入0.5%氨水70%甲醇溶液，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm膜過濾后供液相色譜分析用。該試驗需避光操作。在該試驗的色譜條件下，色譜圖見圖1。

1.2.4含量測定數(shù)學(xué)模型。葉酸含量測定的數(shù)學(xué)模型如下：

式中，X為供試品中葉酸含量（g/kg）；AX為供試品峰面積；AR為葉酸對照品峰面積；WR為葉酸對照品的稱取量（mg）；WX為供試品稱取量（g）；VX為供試品稀釋體積（ml）；VR為對照品稀釋體積（ml）；P對照品純度。

2不確定度來源的識別與分析

2.1不確定度來源根據(jù)含量測定方法及測定數(shù)學(xué)模型分析，葉酸含量測定的不確定度來源主要包括：①對照品純度引入的不確定度；②對照品和樣品的稱量引入的不確定度；③對照品和樣品的定容體積引入的不確定度；④配制對照品和樣品所用到的玻璃量器引入的不確定度；⑤測量重復(fù)性引入的不確定度；⑥標準曲線的擬合等方面引入的不確定度。

2.2不確定度的量化分析

2.2.1對照品純度的不確定度。葉酸對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，純度標示為90.5%，未提供不確定度值，參考基準物質(zhì)不確定度值，設(shè)定對照品含量為90.5%±10%，視為矩形分布，對照品純度相對標準不確定度為：

2.2.2天平稱重的不確定度。葉酸對照品稱重10.47 mg，檢定證書中天平稱量最大允差為±0.1 mg，稱量視為矩形分布（K=3），對照品天平稱重的相對標準不確定度為：

供試品稱重0.1 g，檢定證書中天平稱量最大允差為±0.001 g，稱量視為矩形分布（K=3），供試品天平稱重的相對標準不確定度為：

2.2.3溶液稀釋定容及取樣體積的相對不確定度。

2.2.3.1葉酸對照品溶液稀釋定容及取樣體積的相對不確定度。由JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[7]查得A級100 ml容量瓶的容量允差為±0.10 ml，按矩形分布處理，則葉酸對照品儲備液定容的不確定度為：

配制各濃度對照品溶液分別需使用1 ml（取0.2 ml和 0.8 ml），5 ml（取1.6 ml和4.0 ml）和10 ml（取8 ml和10 ml）的分度吸量管及10 ml容量瓶。JJG 196-2006[5]查得A級1 ml、5 ml和10 ml分度吸量管及10 ml容量瓶的容量允差分別為±0.008 ml、±0.025 ml、±0.05 ml和±0.020 ml，按照矩形分布處理，配制對照品溶液的相對不確定度可表示為：

2.2.3.2供試品溶液稀釋定容及取樣體積的相對不確定度。設(shè)定供試品提取完全，并且濃縮轉(zhuǎn)移也完全，則供試品溶液經(jīng)過了定容于500 ml量瓶，單標線吸量管吸取1 ml，再定容于100 ml量瓶，JJG 196-2006查得A級500 ml容量瓶、1 ml單標線吸量管和100 ml容量瓶的容量允差分別為：±0.25 ml、±0.007 ml和±0.10 ml，均視為矩形分布處理，則上述步驟的相對不確定度分別為：

2.2.4測量重復(fù)性引入的不確定度。取同一供試品溶液，按給定色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD為1.24%，則高效液相色譜儀的相對不確定度為：

2.2.5標準工作曲線擬合過程中引入的相對不確定度。將配制的濃度分別為1.895、7.580、15.160、37.900、75.800、94750 μg/L的一系列對照品溶液分別測定3次，結(jié)果見表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)擬合標準工作曲線為：Y=a+bX =38 165X+4 985.8，γ=0.999 9。

2.3不確定度的合成把以上各不確定度分量的計算結(jié)果列成表2，結(jié)果如下：

2.4不確定度的表示由于最后算得該供試樣品中含有葉酸33.0 g/kg，取95%的置信區(qū)間（K=2），則擴展不確定度表示為U=2×0.026×3.3=1.7 g/kg。葉酸含量應(yīng)表示為：3討論

用高效液相紫外檢測法測定保健食品中葉酸含量的不確定度主要來源于對照品定容體積、純度和稱量以及供試品的稱量引入的不確定度，其次是測量重復(fù)性引入的不確定度。因此在實際檢測工作中，天平的定期檢定，玻璃量器的校準，實驗室溫度的控制以及儀器的定期檢定對進一步提高檢測結(jié)果的準確性和可靠性具有重要意義。

參考文獻

[1] 楊玉柱，王儲炎，焦必寧，等.葉酸的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2006（5）：31.

[2] 羅建波.保健食品中葉酸高效液相色譜測定法[J].職業(yè)與健康，2003（9）：36-37.

[3] 石巖，薛恒躍，魏鋒，等.HPLC測定保健食品中葉酸[J].中國藥事，2010（6）：553.

[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標準出版社，2012.

[5] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-GL06：2006化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S].北京：中國計量出版社，2006.

[6] 中國實驗室國家認可委員會.ISO/IEC17025：2005檢測與校準實驗室認可準則[S].2005.

[7] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2006.