亞硝酸氮濃度變化對感染白斑綜合癥病毒的凡納濱對蝦的影響

摘要[目的]為對蝦產業的健康可持續發展提供依據。[方法]研究不同亞硝酸氮濃度變化對感染WSSV的凡納濱對蝦的影響。[結果]先感染WSSV試驗中，亞硝酸氮濃度在漸變和突變過程中對凡納濱對蝦累積死亡率及病毒增殖的影響顯著（P<0.05）。突變試驗中起始濃度、中濃度、高濃度組凡納濱對蝦的累積死亡率分別為52.2%、70.0%和76.7%，病毒含量分別為7.0×106、1.2×107 和9.4×106 copy/g；漸變試驗中累積死亡率分別為50.0%、63.3%和66.7%，病毒含量分別為4.7×106、2.7×107 和1.1×107 copy/g。后感染WSSV試驗中24 h對蝦死亡率低于12.2%，48 h后突變組首先出現死亡高峰，72～120 h存在顯著差異（P <0.05）；漸變組試驗中起始、中、高濃度亞硝酸氮組凡納濱對蝦的死亡率分別為21.1%、30%和50%，病毒含量分別為9.8×104、2.2×105 和2.3×106 copy/g；突變組試驗中凡納濱對蝦的死亡率分別為31.1%、48.9%和61.1%，病毒含量分別為2.7×105、2.1×106 和5.2×106 copy/g。[結論]攜帶WSSV的凡納濱對蝦對亞硝酸氮濃度變化更敏感，更易引起WSSV從潛伏感染轉為急性感染。亞硝酸氮突變影響對蝦對WSSV的易感性比漸變更為顯著。

關鍵詞 亞硝酸氮；凡納濱對蝦；白斑綜合癥病毒；實時熒光定量PCR；病毒含量

中圖分類號S945.4+9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-01569-04

基金項目廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201301D02）；廣東省良種體系項目（湛財農【2012】221號）。

作者簡介向赟（1987- ），男，湖南懷化人，碩士研究生，研究方向：水產經濟動物生物學及種苗工程。*通訊作者，教授，博士，從事對蝦養殖和病害防治研究和教學工作。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）因其廣溫廣鹽性，含肉率高，繁殖周期長、生長快等特性已成為全世界最主要的對蝦養殖品種之一[1]。近年來，對蝦養殖出現一系列問題（包括水質惡化、病害威脅等），其中白斑綜合癥病毒已對對蝦養殖造成巨大危害。白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是一種傳染性強、宿主廣泛、對蝦高致死性病毒，感染后6～7 d可造成80%～100%的對蝦死亡，危害極大[2]，致使全球對蝦養殖產量嚴重下滑[3]。大量研究表明白斑綜合癥爆發原因很多，包括蝦體免疫水平、感染方式、病毒數量、環境因子等。其中，環境因子包括鹽度、溫度、氨氮含量、pH、亞硝酸氮含量等[4-5]，如高溫或者低溫可以抑制WSSV在對蝦體內增殖[6-8]；亞硝酸氮作為養殖水惡化重要指標之一，對蝦長期處于亞硝酸氮高濃度脅迫下對蝦體內免疫酶活力明顯下降，提高了對病原體的易感性[9]。何建國等[10]認為WSSV的潛伏期感染具有很大的危害性，且潛伏期感染轉為急性感染受眾多氣候和水環境因子的影響。基于此，筆者研究了不同亞硝酸氮濃度變化對感染WSSV的凡納濱對蝦的影響，對對蝦產業的健康可持續發展有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1對蝦來源。健康凡納濱對蝦取自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地，體長為（7.81±0.78） cm。試驗前隨機抽取10尾對蝦進行熒光定量PCR檢測，檢測結果為陰性。試驗前暫養5 d，投喂對蝦人工配合餌料2次/d，換水1次/d，日換水量接近100%。

1.1.2WSSV粗提液的制備。取感染WSSV癥狀明顯的凡納濱對蝦，去除甲殼，按1∶1（W/V）加入高鹽PBS，冰浴中勻漿，將勻漿液于4 ℃、7 000 r/min離心15 min；離心后的上清液加入蔗糖至終濃度為30%（W/W），4 ℃、16 000 r/min超速離心50 min，棄上清，沉淀用PBS（pH 7.4）重懸，將重懸液用0.45 μm的濾膜過濾，分裝后-80 ℃冰箱保存。

1.1.3DNA模板提取和引物設計。DNA模板提取方法參照Sun Y等[11]的方法，PCR引物參照You X等[12]的引物設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1感染方式。試驗采用人工注射感染，在凡納濱對蝦第2腹節與第3腹肌之間往心臟方向注射40 μl用PBS緩沖液稀釋104倍的病毒粗提液。

1.2.2亞硝酸氮濃度變化試驗。試驗水溫為（25±1）℃，鹽度（24±1）‰，亞硝酸氮濃度變化由起始濃度0.05 mg/L往中濃度10 mg/L和高濃度20 mg/L進行突變和漸變，突變時間為6 h，漸變時間為72 h；病毒感染分為變化前和變化后感染2種方式，試驗組和對照組均設置3個平行組，每組對蝦各30尾；試驗組注射40 μl PBS緩沖液稀釋104倍的病毒粗提液，對照組注射40 μl PBS緩沖液。試驗中投喂對蝦人工配合餌料2次/d，24 h充氣，定時吸出排泄物，每天換水量100%，采用重氮-偶氮法來測定水體亞硝酸氮濃度1次/d。及時取出死亡對蝦放入-20 ℃冰箱保存。各組在感染后0、6、12、24、48、72、96 h取樣保存。觀察并記錄對蝦發病及死亡率，定期檢測對蝦組織中病毒含量，并對死亡對蝦進行病毒檢測。

1.2.3病毒檢測方法。病毒檢測采用熒光定量PCR方法，參照程曉燕等[13]方法。

2結果與分析

2.1亞硝酸氮先突變后感染WSSV的結果

2.1.1亞硝酸氮先突變后感染WSSV對凡納濱對蝦死亡情況的影響。從圖1可以看出，對蝦死亡率在突變后感染WSSV至24 h各組均無顯著差異，48 h高濃度感染組和中濃度感染組與其他組存在顯著差異（P<0.05），72 h出現死亡高峰，高濃度感染組明顯高于其他組（P<0.05），96～120 h感染WSSV組累積死亡率顯著高于未感染WSSV組（P<005）；高濃度感染組最大值為61.1%，明顯高于中濃度組的48.9%和起始濃度組的31.3%（P<0.05）。

圖1亞硝酸氮先突變后感染WSSV對凡納濱對蝦累積死亡率的影響2.1.2亞硝酸氮濃度突變后感染WSSV對凡納濱對蝦攜帶WSSV情況的影響。由表1可知，對蝦感染WSSV后，在0～24 h各組中病毒在對蝦體內增殖速度較慢（P>0.05），48 h高濃度感染組病毒增殖明顯快于其他組（P<0.05），72～96 h各組病毒含量基本一致，此時死亡率最高。

2.2先感染WSSV后亞硝酸氮濃度突變的結果

2.2.1先感染WSSV后亞硝酸氮濃度突變對凡納濱對蝦死亡情況的影響。從圖2可以看出，在整個試驗過程中，未感染WSSV組中起始濃度組在12、48、72、96、120 h與其他2個未感染突變組存在顯著差異（P<0.05），感染WSSV組中24 h高濃度感染組明顯高于其他2個組（P<0.05），48～120 h起始濃度感染組始終低于另兩感染突變組（P<0.05），且起始濃度感染組最大值為52.2%，明顯低于中濃度感染組和高濃度感染組。

2.3先亞硝酸氮濃度漸變后感染WSSV試驗結果

2.3.1不同亞硝酸氮濃度對感染WSSV凡納濱對蝦死亡情況的影響。從圖3可以看出，對蝦死亡率在漸變后感染WSSV至24 h各組均無顯著差異，至48 h兩高濃度漸變20 mg/L組與其他組存在顯著差異（P<0.05），高濃度感染組死亡率最高，至72 h出現死亡高峰，特別是高濃度感染組明顯高于其他組（P<0.05），96～120 h感染WSSV組累積死亡率顯著高于未感染WSSV組（P<0.05），高濃度感染組最大值為50.0%，明顯高于中濃度感染組和起始濃度組（P<005）。

2.3.2亞硝酸氮濃度漸變至相應濃度后感染WSSV對WSSV在凡納濱對蝦體內增殖的影響。由表3可知，不同亞硝酸氮濃度下感染WSSV在0～24 h病毒含量低于5.54×104 拷貝/g（P>0.05），48 h后病毒增殖速度加快，高濃度感染組病毒含量明顯高于其他2組（P<0.05），72～96 h病毒含量繼續升高。

2.4先感染WSSV后亞硝酸氮濃度漸變實驗結果

2.4.1亞硝酸氮濃度漸變對攜帶WSSV的凡納濱對蝦死亡情況的影響。從圖4可以看出，對蝦24 h累積死亡率起始濃度組與高濃度感染組存在顯著差異（P<0.05），48～120 h起始濃度組累積死亡率明顯低于高濃度感染組和中濃度感染組（P<0.05）；且起始濃度組累積死亡率最大值為50.0%，低于高濃度20 mg/L組的66.7%和中濃度10 mg/L組的633%。

2.4.2亞硝酸氮濃度漸變對攜帶WSSV的凡納濱對蝦體內病毒增殖的影響。由表4可知，6 h各組之間病毒攜帶量無顯著差異，12、24、48 h起始濃度感染組與高濃度感染漸變組存在顯著差異（P<0.05）；隨著亞硝酸氮濃度的升高，病毒擴增明顯加快，對蝦體內病毒攜帶量隨之增加；72～96 h后各組病毒攜帶量維持較高水平，達到4.2×105～7.3×106 拷貝/g。

3討論

亞硝酸氮是影響蝦類養殖重要的環境脅迫因子之一，高濃度亞硝酸氮可明顯影響凡納濱對蝦的生長和生存[14]。研究表明，亞硝酸氮對機體產生毒害的作用機理是由于亞硝酸氮進入對蝦體內后，使血淋巴中氧合血藍蛋白轉為脫氧血藍蛋白，對氧親和力降低，即降低了機體的輸氧能力，使機體因為缺氧產生損傷[15]。亞硝酸氮也引起日本對蝦（Penaeus japonicus）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）抗病能力下降，血細胞吞噬活力降低，使蝦對病原體的易感性提高[16-18]。Sudha等已將WSSV與印度對蝦（Penaeus indicus）和斑節對蝦（Penaeus monodon）的關系簡單分為3種類型：第1種類型為早期急性感染，第2種類型為急性或亞急性感染，第3種類型為慢性感染，即潛伏感染[19]。

亞硝酸氮濃度突變試驗中發現亞硝酸氮濃度突變對健康凡納濱對蝦的存活有顯著影響，高濃度突變累積死亡率明顯高于其他組，隨著試驗時間的延長，蝦的累積死亡率逐漸升高，說明在亞硝酸氮高濃度脅迫下會對對蝦機體造成嚴重損傷，隨著時間的延長，死亡率升高。亞硝酸氮濃度突變后感染WSSV試驗中發現至24 h各組對蝦累積死亡率低于120%，病毒攜帶量為2.7×103～1.2×104 拷貝/g低于簡旭鳳[20]報道的對蝦死亡時攜帶病毒量1×105 拷貝/g，所以未出現大量死亡。48 h開始出現死亡高峰（P<0.05），整個試驗過程中亞硝酸氮高濃度突變組病毒增殖比其他2組快。這說明亞硝酸氮濃度突變梯度越大，WSSV感染對蝦越快。感染WSSV后亞硝酸氮濃度突變試驗中至24 h高濃度感染組累積死亡率明顯高于另2個感染組，至48 h后起始濃度組累積死亡率明顯低于濃度突變感染組。此結果與陳懷文[21]報道的攜帶WSSV對蝦累積死亡率隨亞硝酸氮濃度升高而升高的結果相符。病毒檢測結果12 h病毒攜帶量為1.1×103～7.0×104 拷貝/g，24 h后迅速升至4.3×104～ 3.3×106 拷貝/g，此時對蝦死亡明顯加快，48 h后病毒含量已經高于簡旭鳳[20]報道的對蝦感染WSSV死亡時攜帶病毒的數量1×105 拷貝/g，對蝦出現大量死亡。綜上所述，亞硝酸氮濃度突然升高會降低健康對蝦的抗病能力，提高對蝦對病原體的易感性，同時會引起病蝦與病原體之間的關系發生變化，使WSSV從潛伏感染轉為急性感染，并縮短發病時間，造成對蝦大量死亡。

2個亞硝酸氮濃度漸變試驗中發現各組對蝦累積死亡率隨著亞硝酸氮濃度的升高而升高；亞硝酸氮濃度漸變后感染WSSV試驗結果發現至48 h死亡率開始出現差異（P<005），48 h病毒含量明顯升高，但低于簡旭鳳[20]報道對蝦感染WSSV粗提液后死亡時攜帶病毒的數量超過1×105 拷貝/g，所以未見大量對蝦死亡，可能原因是亞硝酸氮脅迫時間較短，對蝦對亞硝酸氮濃度變化有一定的適應期，所以在前期感染WSSV對蝦累積死亡率不高。72 h后對蝦累積死亡率迅速升高，兩漸變濃度組的病毒含量為1.5×105～2.3×106 拷貝/g，這與孫成波等發現斑節對蝦在高位池養殖過程中體內病毒含量（9.5×105 拷貝/g）相似[22]，說明隨著亞硝酸氮濃度脅迫時間的延長，亞硝酸氮濃度升高，易感染病原體引起對蝦大量死亡。感染WSSV后亞硝酸氮濃度漸變試驗中發現至24 h累積死亡率就出現顯著差異，此時病毒擴增加快，48 h出現死亡高峰（P<0.05），前期漸變組病毒增殖明顯比起始濃度組快，這可能是因為對蝦機體已經受到WSSV侵染，機體已經受到嚴重損傷，亞硝酸氮濃度變化加重了對蝦機體損傷，導致WSSV快速增殖，引起對蝦迅速死亡。

綜上所述，亞硝酸氮一定濃度范圍內對對蝦毒性可能不大，但是長時間處于一定亞硝酸氮濃度脅迫下會引起對蝦慢性中毒，提高對病原體的易感性，還會使機體受到損傷，嚴重時會引起死亡。攜帶WSSV對蝦對亞硝酸氮的抵抗能力明顯降低，亞硝酸氮濃度升高為WSSV在對蝦體內快速增殖創造了條件，促使WSSV從潛伏感染轉為急性感染。

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