柑橘潰瘍病拮抗放線菌篩選及其抑菌機理研究

摘要[目的]明確保存的放線菌資源對柑橘潰瘍病菌的抑制作用和抑菌機理。[方法]通過平板對峙培養法篩選對柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）有抑制作用的放線菌菌株，并采用電導率法、考馬斯亮藍法和斐林試劑法測定拮抗菌株發酵濾液對潰瘍病菌的影響。[結果]篩選出3個對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的放線菌菌株，抑菌圈直徑達42.0～60.0 mm，且該3株放線菌發酵液能提高潰瘍病菌菌液電導率，增加還原糖和蛋白質含量。[結論]3株拮抗菌能破壞柑橘潰瘍病菌細胞膜完整性，增加細胞膜通透性，引起細胞質外滲。

關鍵詞 柑橘潰瘍病菌；放線菌；拮抗作用；抑菌機理

中圖分類號S436.661.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10547-03

基金項目公益性行業（農業）科研專項（201003067027，201003067026）；西南大學博士基金項目（SWU111044）。

作者簡介馬冠華（1972- ），男，重慶人，副教授，博士，從事植物病害及有益微生物利用研究。

柑橘潰瘍病是由地毯草黃單胞柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri）引起的一種國內外重要的植物檢疫性病害。該病害給世界多個柑橘種植國家和地區帶來巨大經濟損失[1]。當前對該病害的防治除砍伐焚毀外仍以使用化學藥劑為主，但防效欠佳，并且因用藥量大而導致環境污染、農藥殘留及抗藥性等問題出現。有益微生物的利用可以克服化學藥劑所帶來的不利影響，因而部分研究者在潰瘍病的生防細菌利用上開展了一些研究，但主要集中在拮抗菌篩選和盆栽防效試驗上[2-4]，而對抑菌機理的研究較少。放線菌是一類具有重要實用價值的微生物，為獲得更多的可用于防控柑橘潰瘍病的有益放線菌菌株，筆者針對一些對煙草青枯病[5]和野火病[6]等已表現出一定生防潛力的放線菌資源進行了拮抗篩選，并進一步探討了發酵濾液代謝產物對柑橘潰瘍病菌膜透性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。病原菌菌株：柑橘潰瘍病菌Xa1。放線菌菌株：GAS19、CYZ26、YCD272、BX221、YCD171、YSL4、YSL52、FLB22和YYD31共9株。上述菌株由西南大學植物生態病理研究所提供。

1.1.2培養基。肉汁胨培養基（NA）和高氏合成一號培養基（液）按常規方法制作。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株篩選。采用平板對峙法[7-8] 對拮抗放線菌進行初篩，選取有較好拮抗效果的菌株采用氯仿熏蒸法[9]進行復篩，觀察并選取有較強拮抗活性菌株。

1.2.2病菌菌懸液和拮抗菌抑菌粗提物制備。

1.2.2.1柑橘潰瘍病菌菌懸液制備。將病菌于NA培養基上28 ℃培養2 d后，刮下菌苔，用無菌水配成1.5×109cfu/ml菌懸液備用。

1.2.2.2拮抗放線菌抑菌物質粗提。取5個直徑6 mm菌餅接種于裝液量為200 ml的500 ml三角瓶內，28 ℃、180 r/min振蕩培養7 d，將發酵液8 000 r/min離心20 min，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后加入（NH4）2SO4至60%飽和度，靜置2 h，10 000 r/min離心10 min，取沉淀物置于截流分子量為8 000～14 000 u的透析袋中，在0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中透析過夜，然后10 000 r/min低溫離心10 min，上清液即為粗提物原液。

1.2.3柑橘潰瘍病菌菌液電導率測定。參照文獻[10]并略有改動，取粗提物原液，5倍、10倍、20倍、40倍和50倍稀釋液各1 ml，分別加入9 ml潰瘍病菌菌懸液，以無菌水配制相應濃度粗提物作對照，每處理3次重復。28 ℃、180 r/min振蕩培養，在1、2、4、6、8、10、20、30和40 h時測定潰瘍病菌受抑制作用后的相對電導率變化。

1.2.4柑橘潰瘍病菌菌液中還原糖含量測定。參照文獻[11]采用斐林試劑比色法繪制標準曲線并測定菌液中還原糖含量。取放線菌的抑菌粗提物原液和10倍稀釋液1 ml分別加入100 ml菌懸液，以無菌水配制相應濃度粗提物作對照。28 ℃、180 r/min振蕩培養，在2、4、6、8、20和30 h時取10 ml菌液，8 000 r/min下離心 5 min，取上清液6 ml加入4 ml斐林試劑，充分振蕩，反應5 min，在分光光度計波長595 nm下測定吸光度，每處理3次重復。

1.2.5柑橘潰瘍病菌菌液中可溶性蛋白質含量測定。參照文獻[11]利用考馬斯亮藍法G250繪制標準曲線并測定菌液中可溶性蛋白質含量。取放線菌抑菌粗提物原液和10倍稀釋液1 ml分別加入100 ml菌懸液，以無菌水配制相應濃度粗提物作對照。28 ℃、180 r/min振蕩培養，在2、4、6、8、20和30 h時取5 ml菌液，在 8 000 r/min下離心5 min，取上清液1 ml加入5 ml考馬斯亮藍試劑，充分振蕩，反應2 min，在分光光度計波長595 nm下測定吸光度，每個處理3次重復。

2結果與分析

2.1拮抗菌篩選結果利用保存資源中的9個放線菌菌株對柑橘潰瘍病菌進行抑菌測定，初篩發現其中5株表現出一定拮抗活性。復篩發現菌株CYZ26、YCD171和GAS19有很強的抑菌活性，抑菌圈直徑分別達到60.0、48.0和42.0 mm；菌株FLB22和YYD31的抑菌活性相對較差，抑菌圈直徑分別為29.0和9.0 mm（圖1）。注：A.CYZ26；B.YCD171；C.GAS19；D.FLB22；E.YYD31；F.對照。

2.2拮抗放線菌對柑橘潰瘍病菌菌液電導率的影響3株菌抑菌粗提物對柑橘潰瘍病菌菌液作用1 h后，隨著發酵液稀釋倍數的增加，電導率值降低。3株拮抗菌抑菌粗提物原液作用后電導率值遠高于其余處理，5～50倍稀釋液處理后電導率較接近，40倍和50倍下電導率值幾乎相等。在1～40 h測定過程中，3株菌作用效果略有差異。菌株CYZ26原液作用到4 h時電導率下降明顯，到8 h時達最低，到10 h時上升到較高值并隨后基本穩定。而菌株YCD171原液類似反應時間段為4～8 h。菌株GAS19原液在2 h時即開始下降，到8 h上升到高值并基本保持平穩（圖2）。

2.3拮抗放線菌對柑橘潰瘍病菌菌液還原糖的影響斐林試劑測定還原糖標準曲線為y=-0.450 3+18.564 0x，R2=0.979 9，通過測定換算出菌液中還原糖含量。3株放線菌抑菌粗提物的原液和10倍稀釋液對柑橘潰瘍病菌菌液中還原糖含量影響趨勢基本一致，處理2 h時還原糖含量達最大值，隨后逐漸下降，6 h以后基本趨于穩定，菌株YCD171濾液10倍稀釋液處理后還原糖含量在4 h以后仍高于原液處理（圖3）。

2.4拮抗放線菌對柑橘潰瘍病菌菌液中可溶性蛋白質含量的影響考馬斯亮藍法測定蛋白質含量標準曲線為y=0.685 6+0.001 8x，R2=0.958 2，通過測定換算出菌液中蛋白質含量。3個菌株抑菌粗提物原液和10倍稀釋液對柑橘潰瘍病菌菌液中蛋白質含量影響趨勢相似。3個菌株原液作用后菌株GAS19和CYZ26蛋白質含量相對高于菌株YCD71。3株菌10倍稀釋液作用后菌液中蛋白質含量總體趨勢表現較接近。菌株GAS19和CYZ26粗提物原液中蛋白質含量高于10倍稀釋液，表明該2株菌稀釋后抑菌效果降低，而菌株YCD71原液和10倍稀釋差異不大。在測定的2～30 h，各處理在4 h時均表現出蛋白質含量下降，隨后上升，到8或10 h時又表現出一個下降點，隨后再次上升到一個相對穩定的含量水平（圖4）。

3結論與討論

由于放線菌能產生多種拮抗物質而成為生物防治領域的一類重要微生物，目前已發現的超過50%的生物活性物質是由放線菌產生的[12]，并且已有多種抗生素廣泛應用到病害控制中。該試驗從保存的資源庫中篩選到CYZ26等3株放線菌對柑橘潰瘍病菌有很強的拮抗活性，從復篩方法可推斷3株放線菌通過次生代謝產生生物活性物質抑制潰瘍病菌生長繁殖，表現出較好的開發應用潛力。圖2不同拮抗放線菌對柑橘潰瘍病菌菌液電導率的影響圖3不同放線菌抑菌粗提物對柑橘潰瘍病菌還原糖含量的影響圖4不同放線菌抑菌粗提物對柑橘潰瘍病菌菌液中蛋白質含量的影響生防菌用于控制植物病害的作用機理有多種方式，通常以產生抗菌物質、誘導寄主抗性、重寄生和促進植株生長等方面為主。