提取方法對黑木耳多糖提取效果的影響

摘要 以黑木耳為原料，研究緩凍-傳統水提、超低溫凍融-傳統水提、緩凍-超聲和超低溫凍融-超聲4種提取方法對多糖提取率的影響，并與傳統水提法、超聲法提取在提取效果和提取物表面形態上進行比較。試驗結果表明，通過單因素試驗分析，緩凍-傳統水提法、超低溫凍融-傳統水提法、緩凍-超聲法和超低溫凍融-超聲法的黑木耳多糖提取率分別為21.22%、23.60%、7.58%和7.71%，與傳統水提法、超聲法提取相比較，采用相同提取方法（傳統水提）時，提取率為超低溫凍融>緩凍處理>超聲處理。采用掃描電鏡對不同方法提取多糖后黑木耳殘渣進行表面形態觀察，結果表明，提取率更高的黑木耳組織受破壞程度更大，組織間的裂縫和孔隙增大，組織狀態由團狀變為片狀，片狀組織逐漸變薄變細碎，從而有利于多糖的溶出。

關鍵詞 黑木耳；多糖；提取；表面形態

中圖分類號S646.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10664-05

基金項目黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目（GA13B2024）。

作者簡介趙玉紅（1968- ），女，吉林長春人，副教授，博士，從事林特產品精深加工研究。

多糖廣泛存在于高等植物、真菌、藻類中，是細菌和動物細胞膜的組成成分，主要由醛糖和酮糖通過糖苷鍵連接起來。植物多糖是植物細胞代謝產生的由10個以上單糖組成的多聚糖[1-2]，具有多種功能活性如抗氧化、抗疲勞、保肝、抗腫瘤等[3-5]。黑木耳（Auricularia auricula）是我國珍貴的藥食兩用膠質真菌，富含多種人體所需營養物質，如多糖、必需氨基酸、維生素和微量元素等[6]。研究發現，黑木耳多糖具有增強免疫力[7]、抗氧化、抑制腫瘤[8]的功效。目前有關黑木耳多糖的提取方法有鄧慶華等研究的熱水浸提、李超等研究的微波提取和包海花等研究的稀堿提取[9-11]，但依然存在提取率較低，多糖損失嚴重及結構破壞較大的現象，因此開展黑木耳多糖提取效果的研究，可以豐富黑木耳多糖的提取方法，有利于提高多糖提取率。筆者采用緩凍和超低溫凍融作為輔助手段，結合傳統水提和超聲波提取方法提取多糖，并與其在提取效果和表面形態結構上進行對比，以期為黑木耳多糖提取提供新的思路和方法，最大限度地提高多糖提取率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑。原料：黑木耳產自黑龍江省大興安嶺。主要試劑：苯酚、濃硫酸、石油醚、乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉，均為國產分析純。

1.1.2主要儀器。722型分光光度計，上海光譜儀器有限公司；FD150真空冷凍干燥機，上海比朗儀器有限公司；MX2600FE掃描電子顯微鏡，英國Camscan公司；高速中藥粉碎機，浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司；KQ500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TH86150WA -80 ℃超低溫冰箱；BD/BC106E冰柜，星星冰柜；LG微波爐，樂金電子電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；TDL40BW離心機，湖南星科科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1原料預處理。將黑木耳子實體依次清理去雜、55 ℃烘干、高速微細粉碎、脫脂等處理后，過150目篩，制成黑木耳微細干粉備用[12]。

1.2.2緩凍-傳統水提法提取多糖試驗方法。準確稱取1 g黑木耳原料于平皿中，置于冰箱-20 ℃緩凍，研究緩凍時間（8、12、16、20、24 h），熱水提取時間（2、3、4、5、6 h），料液比（1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120 mg/ml），提取的溫度（60、70、80、90、100 ℃）4種因素對多糖提取率的影響。

1.2.3超低溫凍融-傳統水提法提取多糖試驗方法。 準確稱取1 g黑木耳原料于平皿中，置于超低溫冰箱（-80 ℃）冷凍處理，研究超低溫冷凍時間（10、20、30、40、50 min），解凍時間（60、90、120、150、180 s），料液比（1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120 mg/ml），提取溫度（60、70、80、90、100 ℃），提取時間（2、3、4、5、6 h）5種因素對多糖提取率的影響。

1.2.4緩凍-超聲法提取多糖試驗方法。準確稱取1 g黑木耳原料于平皿中，經冰箱緩凍（-20 ℃）處理后，在室溫條件下研究超聲時間（15、20、25、30、25 min），超聲功率（200、250、300、350、400 W），料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 mg/ml）3種因素對多糖提取率的影響。

1.2.5超低溫凍融-超聲法提取多糖試驗方法。準確稱取1 g黑木耳原料于平皿中，經冰箱超低溫（-80 ℃）冷凍處理后，在室溫條件下研究超聲時間（15、20、25、30、25 min），超聲功率（200、250、300、350、400 W），料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 mg/ml）3種因素對多糖提取率的影響。

1.2.6傳統水提法提取多糖試驗方法。按方法“1.2.2”得到的傳統水提條件進行提取。

1.2.7超聲法提取多糖試驗方法。按方法“1.2.4”得到的超聲條件進行提取。

1.2.8黑木耳多糖提取率的測定。葡萄糖標準曲線的繪制參照文獻[13] ，以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標制作標準曲線得到圖1。

式中，C，比照標準曲線的多糖濃度（mg/ml）；V，提取液總體積（ml）；N，稀釋倍數；W，黑木耳原料（g）。

1.2.9黑木耳殘渣表面形態分析。 采用MX2600FE掃描電子顯微鏡對黑木耳表面形態進行分析。將黑木耳提取物離心后，倒出上清液，下層沉淀平鋪于培養皿中，在冰箱（-20 ℃）預凍24 h，冷凍干燥。將干燥樣品取樣粘附在鋁錠上，噴金后的樣品進行掃描電鏡觀察，所有的樣品都在100 μm，300×magnification條件下進行。

2結果與分析

2.1緩凍-傳統水提法對黑木耳多糖提取率的影響

2.1.1緩凍時間對多糖提取率的影響。由圖2（A）可見，在溫度80 ℃，提取時間4 h，料液比1∶80 mg/ml條件下，隨著緩凍時間的延長，多糖提取率逐漸升高，這是因為黑木耳細胞壁經長時間冷凍之后，細胞內產生粗大冰晶刺破細胞壁[14]，時間越長產生冰晶越大，細胞破碎度越大，導致多糖溶出量升高。在緩凍16 h時達到最高，為20.4%，之后提取率略有下降，呈現平穩趨勢。說明16 h時細胞破碎程度達到最大，繼續延長冷凍時間無法提高多糖提取率，如果時間延長，多糖提取率降低，能耗增加，生產成本提高。

2.1.2提取溫度對多糖提取率的影響。由圖2（B）可見，在緩凍16 h，料水比1∶80 mg/ml，提取時間4 h條件下，隨著提取溫度的升高，黑木耳多糖提取率逐漸升高，溫度從60～90 ℃時多糖提取率明顯上升，說明隨著溫度的升高，分子熱運動加快，傳質過程速度加快，導致多糖迅速由高濃度向低濃度液相擴散；90 ℃后上升趨勢變緩，說明此時提高溫度仍有助于多糖提取率提高，多糖熱穩定性比較好，但考慮到高溫造成大幅的能量消耗，且可能對多糖的結構造成損害，故黑木耳多糖的提取溫度采用90 ℃，此條件下提取率為20.83%。

2.1.3料液比對多糖提取率的影響。由圖2（C）可見，在緩凍16 h，溫度90 ℃，提取時間4 h條件下，隨著料液比中溶劑的增加，多糖提取率逐漸增加，到1∶100 mg/ml時提取率達到最大為21.43%，之后多糖提取率略有下降。因為在料液比為1∶100 mg/ml以下時料液兩相濃度差依次增大，加速傳質過程，使多糖溶出量逐漸升高；之后由于黑木耳中的多糖已經基本溶出，過多的料液對傳質過程造成一定的阻礙作用，增加料液比中的溶劑提取率也無明顯變化，故選用料液比1∶100 mg/ml提取。

2.1.4提取時間對多糖提取率的影響。由圖2（D）可見，在緩凍16 h，提取溫度90 ℃，料液比1∶100 mg/ml條件下，在提取時間2～4 h，多糖提取率隨時間延長增加明顯，說明此時溶質與溶劑間的濃度差增大，多糖溶出速率加快；到5 h時達到最高21.98%，但相對于4 h時的21.22%無明顯變化，因為4 h后多糖的溶出速率因溶質與溶劑間的濃度梯度減小而變慢，而6 h時多糖提取率開始下降，可能是因為高溫長時間提取導致部分多糖結構受到破壞。綜合考慮提取時間和提取率，故選用4 h作為適宜的提取時間。

由圖2可知，緩凍-傳統水提法提取黑木耳多糖的適宜提取條件為緩凍16 h，提取溫度90 ℃，料液比1∶100 mg/ml，提取時間4 h，此時多糖提取率為21.22%。圖2緩凍-傳統水提法對黑木耳多糖提取率的影響安徽農業科學2014年2.2超低溫凍融-傳統水提法對黑木耳多糖提取率的影響

2.2.1冷凍時間對多糖提取率的影響。由圖3（A）可見，在超低溫（-80 ℃）冷凍10、20、30、40、50 min，解凍90 s，提取溫度80 ℃，提取時間4 h，料液比為1∶100 mg/ml時測定粗多糖提取率，隨著超低溫冷凍時間的延長，多糖的提取率不斷上升，在30 min提取率為21.22%，時間延長，多糖提取率變化趨于平穩，這是因為構成黑木耳細胞壁的纖維素導熱系數很小[15]，這樣細胞內部溫度變化要比表面溫度變化遲，隨著冷凍時間延長細胞內部溫度逐漸降到最低，解凍時表面溫度迅速上升，導致溫差很大，產生沖擊熱應力，使細胞壁破裂，多糖提取率升高；而繼續增加冷凍時間，細胞內部溫度保持不變，故多糖提取率不再上升。因此，超低溫冷凍時間選取30 min為宜。

2.2.2解凍時間對多糖提取率的影響。由圖3（B）可見，在超低溫冷凍30 min，微波分別解凍60、90、120、150、180 s，提取溫度80 ℃，提取時間4 h，料液比為1∶100 mg/ml時測定粗多糖提取率。在60～120 s時，隨著解凍時間的延長，黑木耳多糖提取率不斷上升，120 s時對應多糖的提取率最高，為22.20%，說明在120 s之前黑木耳細胞表面的溫度逐漸升高，細胞內外溫差不斷增大，從而多糖溶出量逐漸增大。解凍時間超過120 s多糖提取率開始下降，說明黑木耳細胞壁破裂后，表面暴露的部分多糖受到微波熱效應的破壞，導致多糖提取率下降。故采用120 s對超低溫后的黑木耳粉進行解凍。

2.2.3料液比對多糖提取率的影響。由圖3（C）可見，超低溫冷凍30 min，微波解凍120 s，提取溫度80 ℃，提取時間4 h，料液比分別為1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120 mg/ml時測定粗多糖提取率。隨著料液比中溶劑用量的增大，多糖提取率不斷上升，當料液比為1∶100 mg/ml時，多糖提取率達到最高為2172%，因為在料液比為1∶100 mg/ml以下時料液兩相濃度差依次增大，加速傳質過程，使多糖溶出量逐漸升高；之后由于黑木耳中的多糖已經基本溶出，過多的料液對傳質過程造成一定的阻礙作用，增加料液比中的溶劑提取率也無明顯變化，故選用料液比1∶100 mg/ml提取。

2.2.4提取時間對多糖提取率的影響。由圖3（D）可見，超低溫冷凍30 min，微波解凍120 s，提取溫度80 ℃，提取時間分別為2、3、4、5、6 h，料液比為1∶100 mg/ml時測定粗多糖得率。在提取時間2～4 h時，多糖提取率隨時間延長增加顯著，說明此時溶質與溶劑間的濃度差增大，多糖溶出速率加快；到4～5 h時保持平穩，提取率達到最高值21.91%，因為4 h后多糖的溶出速率因溶質與溶劑間的濃度梯度減小而變慢，甚至保持不變；而6 h時多糖提取率略有下降，可能是因為高溫長時間提取導致部分多糖結構受到破壞。綜合考慮提取時間和提取率，故選用4 h作為適宜提取時間。

2.2.5提取溫度對多糖提取率的影響。由圖3（E）可見，超低溫冷凍30 min，微波解凍120 s，提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為4 h，料液比為1∶100 mg/ml時測定粗多糖提取率。在60～90 ℃時，隨著溫度的升高，多糖提取率明顯提高，到90 ℃時達到最大值23.6%，說明隨著溫度的升高，分子熱運動加快，傳質過程速度加快，導致多糖迅速由高濃度向低濃度液相擴散；90 ℃后多糖提取率開始下降，表明經超低溫凍融處理的黑木耳多糖細胞壁破碎明顯，在90 ℃時大部分多糖已經溶出，之后繼續升溫溶出的多糖結構受到高溫破壞，導致提取率下降。

由圖3可知，超低溫凍融-傳統水提法的適宜提取條件為冷凍時間30 min，微波解凍時間120 s，料液比1∶100 mg/ml，提取時間4 h，提取溫度90 ℃，此時多糖提取率為23.6%。圖3超低溫凍融-傳統水提法對黑木耳多糖提取率的影響2.3緩凍-超聲法與超低溫凍融-超聲法對黑木耳多糖提取率的影響

2.3.1超聲時間對多糖提取率的影響。在緩凍16 h，室溫25 ℃超聲，超聲功率300 W，料液比1∶60 mg/ml，超聲時間15、20、25、30、35 min，研究超聲時間對多糖提取率的影響，結果如圖4所示。

2.3.2料液比對多糖提取率的影響。緩凍16 h，室溫25 ℃超聲，超聲功率300 W，超聲時間25 min，研究料液比對多糖提取率的影響，結果如圖5所示。

2.3.3超聲功率對多糖提取率的影響。在緩凍16 h，室溫25 ℃超聲，料液比1∶70 mg/ml，超聲時間25 min，研究超聲功率對多糖提取率的影響，結果如圖6所示。

2.4傳統水提法提取黑木耳多糖的試驗結果采用方法“2.1”的提取條件，即提取時間4 h，提取溫度90 ℃，料液比1∶100 mg/ml時，傳統水提法多糖的提取率為19.79%。

2.5超聲法提取黑木耳多糖的試驗結果采用“2.3”的方法，即超聲時間25 min，料液比1∶70 mg/ml，超聲功率300 W時，室溫超聲法提取多糖的提取率為6.49%。

2.6不同提取方法提取效果比較 由圖7可知，這6種提取方法中除D、E差異不顯著（P>0.05）之外，其他方法兩兩之間均具有顯著性差異（P<0.05）。綜合比較圖7，可以看出超低溫凍融-傳統水提法最為優越，并且采用緩凍和超低溫凍融處理提取率要高于傳統水提法；而在室溫25 ℃超聲提取多糖提取率最低，采用超低溫凍融和緩凍處理后的提取率與單純采用超聲法之間差異顯著（P<0.05）。

2.7黑木耳提取物表面形態觀察結果如圖8所示，A～F是6種提取方法提取率由高到低排列的表面形態電鏡掃描圖，G圖是粉末狀黑木耳原料的電鏡掃描圖。由以上圖片可以看出，黑木耳原料粉末是完整的顆粒狀組織，顆粒大小不一，形狀不規則，較為復雜，表面沒有裂紋和組織縫隙[16]；而經不同提取方法作用后的黑木耳粉末，在形態上表現為片狀或團狀結構，黑木耳表面出現明顯的裂紋和組織縫隙，且隨著提取率的升高裂紋不斷增大，組織孔隙也增大，并且在提取率較低時，黑木耳表面呈較為緊實的塊狀或團狀，提取率較高時，逐漸變為很薄的片狀結構，提取率越高片狀結構越小、結構越疏松，這種結構增大了與溶劑的接觸面積，從而促進多糖的溶出[17-18]。結果表明，提取率越高，樣品組織所受的破壞程度越大，更易于與提取溶劑充分接觸，有利于多糖的提取。

3結論與討論

通過對黑木耳多糖提取效果的研究和表面形態觀察，可以看出，緩凍和超低溫凍融這2種提取手段能提高黑木耳多糖的提取率，并且超低溫凍融法提取效果要好于緩凍法。電鏡掃描結果也進一步證明，經超低溫凍融處理的樣品，表面結構要比其他提取方法的片薄，組織更為疏松，細胞受破壞程度更加強烈，原因可能是超低溫凍融解凍采用的是微波快速解凍，黑木耳粉吸收微波能量而產生大量的熱量，導致細胞壓力升高，從而使細胞膜和細胞壁形成孔洞，有利于多糖的溶出；相同提取方法（傳統熱水提）時的提取率，超低溫處理>緩凍處理>超聲處理；隨著多糖提取率的升高，黑木耳表面結構變疏松，結構由團狀變為片狀，且變為很薄的碎片，從而增大與溶劑的接觸面積，有利于多糖的溶出。