不同栽培區附子生物堿含量的比較研究

摘要[目的]比較不同栽培區附子生物堿的含量。[方法]采用冷浸法測定水浸出物和醇浸出物含量，酸性染料比色法測定附子總生物堿含量，RPHPLC測定雙酯型生物堿含量。[結果]6個栽培區附子水溶性浸出物含量為10.272%～11.681%，醇溶性浸出物含量為1.621%～3.195%，總生物堿含量為0.987%～1.346%，中烏頭堿含量為0.349～3.268 mg/g，烏頭堿含量為0.406～0.841 mg/g，次烏頭堿含量為1.284～3.134 mg/g。[結論]不同栽培區附子浸出物、總生物堿和雙酯型生物堿含量差異較大，其結果為附子藥材質量評價提供一定的理論參考。

關鍵詞 附子；浸出物；總生物堿；雙酯型生物堿

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10519-02

基金項目國家“十二五”科技支撐計劃課題（2011BAI13B05）；四川省“十二五”農作物育種攻關課題（2011NZ009812）；西南科技大學博士基金項目（14zx7110）。

作者簡介舒曉燕（1974- ），女，陜西漢中人， 副教授，博士，從事中藥化學及資源學研究。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事藥用植物學相關研究。

附子為毛茛科植物烏頭（A.carmichaeli Debx.）的子根，始載于《神農本草經》，列為下品。其主要有效成分為二萜類雙酯型生物堿，包括中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿等，是一類毒性較強的成分，且用藥劑量與中毒劑量接近，使用不當易造成中毒甚至死亡[1-2]。附子是許多中成藥和成方制劑的主要原料藥之一，市場需求量大。在四川、陜西、云南和湖北等省均有栽培，以四川、陜西的產量最大。研究表明，附子具有抗心律失常、舒張血管、鎮痛、抗衰老、抗腫瘤及調節免疫等多種藥理作用及某些毒性[3-4]。由于生態環境和栽培條件的不同，中藥材原植物的形態習性、藥材的形狀構造及藥材的品質等均有可能發生變化。該試驗通過在四川和陜西附子主要栽培區采集樣本，對其烏頭類總生物堿和雙酯型生物堿含量進行研究，以期為附子的質量評價提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1材料試驗材料于2013年7～8月采集于陜西和四川附子主要栽培區，經西南科技大學侯大斌教授鑒定為Aconitum carmichaeli Debx.。附子樣品來源如表1所示。

1.2儀器Varian 1200LC/MS液相色譜-質譜聯用儀（UV檢測器，Varian公司）；紫外可見分光光度計（Ultrospec 3300 pro，Amersham Biosciences）；旋轉蒸發系統（BCHI公司）；電子分析天平（BS124S，Sartouius公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3主要試劑乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。中烏頭堿（NO.110799200404）、烏頭堿（NO.110797200404）、次烏頭堿（NO.110798200404）對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4方法

1.4.1供試樣品的處理。泥附子先用自來水清洗干凈，再用超純水漂洗2次，切成0.3 cm厚的片狀，裝入牛皮紙袋放入烘箱，105 ℃烘30 min，在60～70 ℃下烘干至恒重。粉碎，過60目篩，4 ℃冰箱保存，備用。

1.4.2不同栽培區附子浸出物含量的測定。精密稱取附子粉末1.000 g，置于100 ml錐形瓶中，精密加水（或95%乙醇）25 ml，按照2010 版《中華人民共和國藥典》一部附錄X A浸出物測定法[5]，采用冷浸法考察水浸出物和醇浸出物含量。

1.4.3不同栽培區附子總生物堿含量的測定。附子總生物堿含量的測定采用酸性染料比色法[6]。以烏頭堿的濃度（C，μg/ml）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=31.182X+0.042 5（r=0.999 1），烏頭堿含量在1.68～19.8 μg/ml范圍內，其吸光度與烏頭堿濃度呈現出良好的線性關系。

1.4.4不同產地附子3種雙酯型生物堿含量的測定。

1.4.4.1供試品溶液的配制。精密稱取附子粉末0.500 g，置于錐形瓶中加濃氨水2 ml浸潤，再加入乙醚20 ml，超聲提取50 min，過濾，殘渣用乙醚洗滌3次，每次10 ml，合并提取液，旋蒸除去乙醚，用甲醇定容至10 ml容量瓶中，作為供試品溶液。

1.4.4.2對照品溶液的配制。精密稱取中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，分別置于10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，得各單一成分對照品溶液，作為儲備液。其他不同濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。

1.4.4.3色譜條件。采用Zorbax extendC18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm） 色譜柱，流動相為乙腈（A）0.1%乙二胺（B），梯度洗脫，在0～15 min（35%～50% A）、15～30 min（50%～75% A）、30～35 min（75%～35% A）、35～60 min（35% A），進樣量20 μl，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長240 nm。

2結果與分析

2.1不同栽培區附子浸出物的含量從表2可以看出，附子不同栽培區浸出物含量存在一定的差異，樣品3水溶性和醇溶性浸出物的含量均為最高，分別為11.681%、3.195%，樣品1兩種浸出物含量均為最低，分別為10.272%、1.621%；經過方差分析，各栽培區附子水溶性浸出物含量差異不顯著（P>005），醇溶性浸出物含量差異顯著（P<0.05）。

2.2不同栽培區附子總生物堿的含量由表3可知，6個栽培區附子總生物堿含量均約1.0%，樣品3總生物堿含量最高，為1.346%，樣品1最低，為0.987%；方差分析結果表明，不同栽培區附子總生物堿含量差異不顯著（P>0.05）。

2.3不同栽培區附子3種雙酯型生物堿的含量

2.3.1線性關系考察。吸取一定量的3種生物堿的儲備液混合，不同梯度進樣，平行測定3次。以平均峰面積（Y）對質量濃度（X，μg/ml）進行線性回歸，中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的回歸方程分別為Y=5.485×105X-5.084（r=0.999 8）、Y=3.336×105X-8.701（r=0.999 5）、Y=3.899×105X-26.657（r=0.999 7），可見，中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿分別在0.46～2.31、0.26～1.29和0.46～2.28 μg/ml線性關系良好。

2.3.2最低檢出限。用信噪比為3計算，中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的最低檢出限分別為6.3、4.5、6.9 ng。

2.3.3精密度試驗。吸取供試品（樣品2）溶液20 μl，重復進樣5次，進行測定。中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.04%、2.47%和1.98%。

2.3.4重復性試驗。稱取干燥附子粉末（樣品2）5份，每份0.500 g，制成供試品溶液，進樣測定。經分析得出中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.79%、2.40%、2.56%。

2.3.5穩定性試驗。供試品（樣品2）溶液每隔1 h考察1次，共進行8次。結果表明，中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.23%、2.35%和2.07%。

2.3.6加標回收試驗。精密稱取0.500 g附子粉末（樣品2）5份，每份準確加入3種生物堿儲備液，使烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿的含量分別為200、450、400 μg，制成供試品溶液，進樣測定。結果顯示，中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的平均加樣回收率（n=5）分別為98.7% 、98.9%和99.1%，RSD值分別為2.82%、2.34%和2.75%。

2.3.7樣品測定。不同栽培區的附子樣品，制備成供試品溶液，進樣10 μl，進行測定。用回歸方程計算中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的含量。由表4可知，6個栽培區附子3種雙酯型生物堿含量差異較大，中烏頭堿含量在0.349～3.268 mg/g，烏頭堿含量在0.406～0.841 mg/g，次烏頭堿含量在1284～3.134 mg/g。樣品3中3種雙酯型生物堿總含量最高。

3討論